Наредба № 44 от 7 октомври 2002 г. за вземане на проби и методи за анализ при контрол на фуражите

Чл. 1

С тази наредба се уреждат редът за вземане на проби и методите за анализ при контрол на фуражите.

Чл. 2

Вземането на проби се извършва от инспектори на Главната дирекция за контрол на фуражите (ГДКФ) в Националната служба по зърното и/или от инспектори на Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС).

Чл. 3

(1) За вземане на проби се използват уреди, изработени от материали, невлияещи на фуражите, от които се взема пробата.

(2) За вземане на единични проби се използват уредите, посочени в приложение №1.

Чл. 4

От партидите фуражи се вземат следните видове проби:

1. единична проба (извадка);

2. сборна проба (изходна);

3. редуцирана сборна проба (средна проба);

4. крайна проба (лабораторна).

Чл. 5

(1) За контрол на фуражите се използват партиди с размери, които дават възможност за вземане на достатъчно проби, представителни за всички части на партидата.

(2) В зависимост от вида на фуража и размера на партидата се вземат минимален брой единични проби съгласно приложение № 2.

(3) Когато не могат да бъдат взети единични проби от всички части на партидата поради нейния размер или местоположение, за размер на партидата се приема само частта, от която са взети единичните проби.

Чл. 6

(1) Пробите се вземат и образуват по възможно най-бърз начин, който изключва тяхното замърсяване и изменение в сравнение с останалата част на партидата.

(2) За вземане и образуване на проби се използват почистени и подсушени инструменти, работни повърхности и съдове.

(3) Инспекторите вземат нужните предпазни мерки за предотвратяване изменението на състава, замърсяването и повреждането на пробата по време на транспорт и съхранение.

Чл. 7

(1) Единичните проби при контрол на вещества или субстанции, разпределени равномерно във фуражите, се вземат произволно от цялата партида. Те трябва да са с еднакво тегло или обем.

(2) При вземане на единични проби от насипни фуражи, които са в съдове над 100 kg, партидата мислено се разделя на равни части и се взема необходимият брой проби съгласно приложение № 2.

(3) При вземане на единични проби от опаковани фуражи от всяка опаковка се взема част от съдържанието.

(4) При вземане на единични проби от течни или полутечни смесими фуражи от всяка опаковка или съд се взема най-малко една проба. Единичната проба се взема след хомогенизиране съдържанието на фуража.

(5) При вземане на единични проби от течни и полутечни фуражи, които не могат да се смесват, се вземат проби от различни височини на съдовете съгласно приложение № 2. В тези случаи обемът на сборните проби е минимум 10 l.

(6) При вземане на единични проби от фуражи на блокчета или „буци за лизане“ от всеки фуражен блок или „буца за лизане“ се взима по една част.

Чл. 8

(1) От единичните проби, взети от една партида, се образува само една сборна проба, с изключение на сборната проба за анализ на нежелани или забранени вещества, която се образува съгласно приложение № 3.

(2) Сборните проби се образуват от единичните проби съгласно приложение № 4. При образуване на сборна проба единичните проби се размесват добре.

Чл. 9

(1) При образуване на сборни проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно, партидата се разделя мислено на толкова части, колкото са сборните проби, посочени в приложение № 3. Общият брой единични проби, взети от партидата, се разпределя приблизително равномерно в тези части, като във всяка сборна проба се включват единични проби, взети от различни части на партидата.

(2) Сборните проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно в партидата, са не по-малки от 4 kg или 4 l.

Чл. 10

(1) Сборните проби се образуват чрез смесване до получаване на еднородна смес. Буците се начупват отделно от останалия материал, след което се смесват с него.

(2) За образуване на крайна проба може да се образува редуцирана сборна проба, като сборната проба се намали до 2 kg или 2 l чрез механичен разделител или чрез разчетворяване.

Чл. 11

(1) От всяка сборна проба или редуцирана сборна проба се образуват най-малко три крайни проби.

(2) Според вида на партидата минималното количество на крайната проба се определя съгласно приложение № 5.

Чл. 12

(1) Крайните проби се съхраняват в чисти и сухи опаковки или съдове, които не пропускат влага и се затварят добре. При възможност се използват съдове, които се затварят херметически.

(2) Съдовете по ал. 1 се пломбират или запечатват така, че при отваряне на съда да се наруши целостта на пломбата или печата.

Чл. 13

(1) При вземане на проби се съставя протокол за вземане на проби в три екземпляра, в който се посочват видът и номерът на партидата, от която са взети.

(2) Всяка крайна проба се придружава от екземпляр от протокола по ал. 1.

Чл. 14

(1) Крайните проби се означават с етикети, които съдържат:

1. име и адрес на инспектора;

2. дата на образуване на крайната проба;

3. номер и дата на протокола за вземане на проби;

4. описание на фуража;

5. номер на пломбата или печата.

(2) В етикета могат да се включат и други данни за пробата.

Чл. 15

Инспекторите изпращат една крайна проба на лабораторията, която ще извърши анализите, втората крайна проба се предава за съхранение на собственика на партидата, а третата се съхранява от контролния орган за евентуален арбитражен анализ.

Чл. 16

При контрол на качеството и на съдържанието на вещества във фуражите пробите се анализират по методите, посочени в приложение № 6.

Чл. 17

(1) Методите за анализ по приложение № 6 се прилагат за всички видове фуражи.

(2) Когато някой от методите има специално приложение при анализа на определени видове фуражи, то е посочено в точка „Наблюдения“ на съответния метод.

Чл. 18

(1) За анализ на всяко вещество във фуражите се използва един от методите по приложение № 6.

(2) Когато за анализ на едно вещество могат да се използват два или повече метода, включени в приложение № 6, изборът на метод се извършва от лабораторията, която прави анализа. Избраният метод се означава в анализното свидетелство.

Чл. 19

При описание на методите за анализ в приложение № 6 са посочени само уредите и апаратите, които са специални или са по специален стандарт, без да се посочва оборудването, което е обичайно за лаборатории за анализ.

Чл. 20

(1) Лабораторията отразява резултатите от проведените анализи в анализно свидетелство.

(2) Резултатите от анализа представляват средна стойност от поне две изследвания. Резултатите от анализа са с такава точност, каквато методът за анализ позволява.

§ 1

По смисъла на тази наредба:

1. „Партида“ е определено количество фураж, представляващо еднородна маса, което е продукт на непрекъснат производствен процес и се предлага на пазара като цяло.

2. „Единична проба“ (извадка) е определена част от партидата фуражи, която се взема еднократно от определено място на партидата и служи за съставяне на сборна (изходна) проба.

3. „Сборна проба“ (изходна) е общото количество от всички единични проби (извадки), взети от една партида.

4. „Редуцирана сборна проба“ е представителната част от формираната сборна (изходна) проба.

5. „Крайна проба“ (лабораторна) е определено количество от формираната сборна (изходна) или редуцираната сборна проба.

§ 2

Наредбата се издава на основание чл.11, ал.3 от Закона за фуражите (обн., ДВ, бр. 82 от 1999 г.; изм., бр. 101 от 2000 г.).

§ 3

Изпълнението на наредбата се възлага на ръководителите на Националната служба по зърното и Националната ветеринарномедицинска служба.

Приложение 1 Приложение № 1 към чл.3, ал.2

Уреди за вземане на единична проба А. Ръчни уреди:

1. сонди за вземане на проби с дълъг прорез или камери, съответстващи на размера на партидата и на размера на частиците на веществата;

2. лопатки с равна основа и огънат под прав ъгъл нагоре кант. Б. Механичен уред за вземане на проби от веществата по време на производствения процес – автоматичен пробовземач. В. Уреди за вземане на единични проби от течни или полутечни вещества:

1-dup. пипета;

2-dup. уред за черпене с устройство за затваряне. Г. Делителни устройства за създаване на редуцирани, сборни и крайни проби:

1-dup2. делителен конус;

2-dup2. делител многоулеен.

Приложение 2 Приложение № 2 към чл.5, ал.2

Минимален брой единични проби, взимани от партидите Вид и количество на партидата Минимален брой единични проби (извадки)

1. Твърди вещества неопаковани (насипни) и вещества в съдове над 100 kg: Силаж от зелен фураж, листа от цвекло, сено и слама 20 Ливадни растения 50 Други вещества До 2,5 t 7 Над 2,5 t Корен квадратен от 20-кратното тегло на партидата, изразено в тонове, максимум 40

2. Опаковани вещества

2.1. Опаковки със съдържание до 1 kg 4

2.2. Опаковки със съдържание над 1 kg:

3. Течни или полутечни вещества: Съдове

3.1. В съдове с вместимост над 1 l

3.2. Съдове с вместимост до 1 l 4

4. Фуражни блокчета и буци за близане По 1 от партида от 25 единици – максимум 4

Приложение 3 Приложение № 3 към чл. 8, ал. 1

Минимален брой сборни проби за анализ на нежелани или забранени вещества Вид и размер на партидата, тон/опаковки Минимален брой сборни (изходни) проби, взети от една партида Насипни, неопаковани: До 1 t 1 Над 1 t до 10 t 2 Над 10 t до 40 t 3 Над 40 t 4 Опаковани: До 16 опаковки 1 От 17 до 200 опаковки 2 От 201 до 800 опаковки 3 Над 800 опаковки 4

Приложение 4 Приложение № 4 към чл.8, ал. 2

Минимално тегло на сборните проби Вид и количество на партидата Минимално тегло на сборната (изходната) проба

1. Насипни, неопаковани и фуражи в съдове: – Сено, слама 1kg – Други фуражи 4kg

2. Опаковани фуражи

2.1. В опаковки със съдържание до 1 kg Съдържанието на 4 опаковки

2.2. В опаковки със съдържание над 1 kg 4 kg

3. Течни или полутечни фуражи:

3.1. В съдове с вместимост до 1 l Съдържание на 4 съда

3.2. В съдове с вместимост над 1 l 4 l

4. Фуражни блокчета и буци за близане

4.1. С единично тегло до 1 kg 4 броя

4.2. С единично тегло над 1 kg 4 kg

5. Добавки 200 g или 200 ml

6. Премикси 1 kg или 1 l

Приложение 5 Приложение № 5 към чл. 11, ал. 2

Минимално тегло на крайните проби Вид партида Минимално тегло на крайна (лабораторна) проба

1. Твърди фуражи: Сено, слама 250 g Ливадни растения, зелени фуражи, зелен силаж и други сочни фуражи 1 kg Други фуражи 0,5 kg

2. Течни или полутечни фуражи 0,5 l

3. Добавки 50 g

4. Премикси 250 g

Приложение 6 Приложение № 6 към чл. 16

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ ОБЩИ ИЗИСКВАНИЯ А. Подготовка за анализ Процедурите по подготовка на пробите за анализ се отнасят до крайните проби, които са изпратени на контролните лаборатории, след като са взети в съответствие с изискванията на Наредбата за методите за вземане на проби при официалния контрол на фуражите. Пробите трябва да са взети по такъв начин, че отделените за анализ количества, както е регламентирано в аналитичните методи, да са хомогенни и представителни за крайните проби. Всички необходими процедури при взимането на пробата се извършват така, че в максимална степен да се избегне замърсяването на пробата и промените в нейния състав. Смилането, разбъркването и пресяването се извършват възможно най-бързо, при минималното излагане на пробата на въздух и светлина. Не трябва да се използват смилащи устройства, които могат значително да нагреят пробата. Препоръчително е фуражите, които са особено чувствителни към топлина, да се смилат ръчно. Необходимо е да се вземат предпазни мерки използваната апаратура да не представлява източник на остатъчно замърсяване. Съдържанието на влага се измерва преди и след изготвянето на пробата, ако при подготовката на пробата се промени съдържанието на влага. Окончателната проба се разбърква добре механично или на ръка и се разделя на две еднакви части (ако е възможно, се използва методът на четвъртинките). Запазва се едната от частите в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка, а другата част или представителна част от нея, не по-малко от 100 g, се подготвя по следния начин ХLIХ. Определяне на натриев лазалоцид Натриева сол на полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis 1. Цел и обхват С този метод се определя съдържанието на натриев лазалоцид в храните за животни и премиксите. Границата на откриване е 5 mg/kg, а границата на определяне е 30 mg/kg. 2. Принцип Натриев лазалоцид се извлича от проба в подкислен метанол и се определя чрез високо-ефективна течна хроматография (HPLC) с обратна фаза, с помощта на спектрофлуориметричен детектор. 3. Реактиви 3.1. Калиев дихидрогенфосфат (КН2РО4) 3.2. Ортофосфорна киселина, w = 85 % 3.3. Разтвор на ортофосфорна киселина, σ = 20 % Разредете 23,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) до 100 ml с вода. 3.4. 6-Метил-2-хептиламин (1,5-диметилхексиламин), w = 99 % 3.5. Метанол, клас HPLC 3.6. Солна киселина, ρ20 1,19 g/ml 3.7. Буферен разтвор на фосфат, с = 0,01 mol/l Разтворете 1,36 g от КН2РО4 (3.1) в 500 ml вода (3.11), добавете 3,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) и 10,0 ml 6-метил-2-хептиламин (3.4). Прибавете разтвор на ортофосфорна киселина (3.3) до получаване на рН 4,0 и разредете до 1000 ml с вода (3.11). 3.8. Подкислен метанол Прехвърлете 5,0 ml солна киселина (3.6) в 1000 милилитрова мерителна колба, допълнете с метанол (3.5) до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба. 3.9. HPLC мобилна фаза, фосфато буферен метанолен разтвор 5 + 95 (V + V) Смесете 5 ml от фосфатния буферен разтвор (3.7) с 95 ml метанол (3.5). 3.10. Стандартна субстанция на натриев лазалоцид с гарантирана чистота, C14H53O8Na (натриева сол на полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis), Е763 3.10.1. Основен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 500 μg/ml Претеглете с точност до 0,1 mg и поставете 50 mg натриев лазалоцид (3.10) в мерителна колба от 100 ml, разтворете в подкислен метанол (3.8), допълнете със същия разтворител до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба. 3.10.2. Междинен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 50 μg/ml Отмерете с пипета 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в мерителна колба от 100 ml, допълнете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба. 3.10.3. Калибрационни разтвори Прехвърлете съответно 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 ml от междинния стандартен разтвор (3.10.2) в серия от 50-милилитрови градуирани колби. Допълнете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Тези разтвори отговарят съответно на 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 mg натриев лазалоцид на ml. Разтворите трябва да бъдат прясно приготвени преди употреба. 3.11. Вода, клас HPLC 4. Апаратура 4.1. Ултразвукова вана (или вибрираща водна баня) с регулиране на температурата 4.2. Мембранни филтри, 0,45 μm 4.3. Оборудване за HPLC с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 20 μl. 4.3.1. Колона за течен хроматографски анализ 125 mm x 4 mm, обратна фаза С18, опаковка 5 mm или еквивалент 4.3.2. Спектрофлуориметър с регулиране за промяна на дължините на вълните при възбуждане и емисия 5. Процедура 5.1. Общо описание 5.1.1. Празна проба храна за животни За изпълнението на теста за извличане (5.1.2) следва да се анализира проба храна за животни, за да се провери за наличие на натриев лазалоцид и пречещи субстанции. Храната за животни от пробата трябва да е подобен по вид на този от изследваната проба и в него не трябва да се открива наличие на натриев лазалоцид или пречещи субстанции. 5.1.2. Тест за извличане Тестът за извличане се извършва, като се анализира пробата храна за животни, обогатена чрез прибавяне на такова количество натриев лазалоцид, близко до наличното в пробата. За да обогатите при ниво 100 mg/kg, пресипете 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в конична колба от 250 ml и изпарете разтвора, докато получите приблизително 0,5 ml. Добавете 50 g проба храна за животни, смесете добре и оставете да престои 10 минути. Разбъркайте отново няколко пъти, преди да преминете към екстракцията (5.2). Като алтернатива, ако не разполагате с храна за животни за проба, подобен по вид на този от изследваната проба (виж 5.1.1), тестът за извличане може да се извърши чрез стандартен метод на добавяне. В този случай пробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество натриев лазалоцид, което е близко до наличното в пробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като извличането се калкулира чрез изваждане. 5.2. Екстракция 5.2.1. Храни за животни Претеглете с точност до 0,01 g и поставете от 5 g до 10 g от пробата в 250-милилитрова конична колба с тапа. Прибавете с пипета 100,0 ml подкислен метанол (3.8). Запушете леко с тапата и разклатете, за да може съдържанието да се диспергира. Поставете колбата в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40 °С за 20 минути, след което я отместете и охладете до стайна температура. Оставете да престои около 1 час, докато суспензията се утаи, след което филтрирайте в подходящ съд една аликвотна част през мембранен филтър 0,45 μm (4.2). Пристъпете към определяне чрез HPLC (5.3). 5.2.2. Премикси Претеглете с точност до 0,001 g и поставете около 2 g несмлян премикс в мерителна колба от 250 ml. Прибавете 100,0 ml подкислен метанол (3.8) и разклатете, за да може съдържанието да се диспергира. Поставете колбата със съдържанието в нея в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40 °С за 20 минути, след което отместете и охладете до стайна температура. Разредете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и смесете добре. Оставете да престои около 1 час, докато суспензията се утаи, след което филтрирайте една аликвотна част през мембранен филтър 0,45 μm (4.2). Разредете подходящ обем от чистия филтрат с подкислен метанол (3.8), за да получите окончателен разтвор за тестване, който съдържа около 4 μg/ml натриев лазалоцид. Пристъпете към определяне чрез HPLC (5.3). 5.3. Определяне чрез HPLC 5.3.1. Параметри Следните условия се посочват като указващи; може да се използват други, при условие че дават равностойни резултати: Колона за течен хро- 125 mm x 4 mm, обрат- матографски анализ на фаза С18, опаковка (4.3.1): 5 μm или еквивалент Мобилна фаза (3.9): Смес на фосфатен буферен разтвор (3.7) и метанол (3.5), 5 + 95 (V +V) Скорост на пропускане: 1,2 ml/min Дължина на детекция: - Възбуждане: 310 nm - Емисия: 419 nm Инжекционен обем: 20 μl Проверете стабилността на хроматографската система, като инжектирате няколко пъти калибрационен разтвор (3.10.3), съдържащ 4,0 mg/ml, докато бъдат постигнати постоянни пикови височини (или площи) и времена на задържане. 5.3.2. Калибрираща графика Инжектирайте от всеки калибрационен разтвор (3.10.3) по няколко пъти и определете средните пикови височини (площи) за всяка концентрация. Начертайте калибрираща графика, като използвате средните пикови височини (площи) за ординати, а съответстващите концентрации - за абсциси 5.3.3. Разтвор на пробата Инжектирайте няколко пъти получените в 5.2.1 или 5.2.2 екстракти от изследваната проба, като използвате същия обем, взет при калибрационния разтвор, и определете средните пикови височини (площи) на пиковете на натриевия лазалоцид. 6. Изчисление на резултатите От средната пикова височина (площ), получена чрез инжектиране на разтвора на пробата (5.3.3), определете концентрацията на натриев лазалоцид (μg/ml) по калибриращата графика. 6.1. Храни за животни Съдържанието на натриев лазалоцид, w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула: ß. V1 w = --------------- [mg/kg], където: m ß = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.1) в mg/ml; V1 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.1 в ml (т.е. 100); m = масата в g на взетата за анализ част. 6.2. Премикси Съдържанието на натриев лазалоцид w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула: ß. V2. f w = ----------------- [mg/kg], където: m ß = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.2) в μg/ml; V2 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.2 в ml (т.е. 250); f = фактор на разреждане, съгласно 5.2.2; m = масата в g на взетата за анализ част. 7. Потвърждаване на резултатите 7.1. Идентичност Методите, които са базирани на спектрофлуориметрията, са в по-малка степен подложени на смущения, отколкото тези, при които се използва UV детекция. Идентичността на анализа може да се потвърди чрез ко-хроматография. 7.1.1. Ко-хроматография Обогатява се екстракт от пробата (5.2.1 или 5.2.2), като се добави подходящо количество калибрационен разтвор (3.10.3). Количеството добавен натриев лазалоцид трябва да бъде близко до това, открито в екстракта от пробата. На базата на добавеното количество натриев лазалоцид и разреждането на екстракта следва да се увеличи само височината на пика на натриевия лазалоцид. Широчината на пика при половин височина трябва да бъде в границите на ± 10 % от оригиналната широчина на пика, получен при необогатения екстракт от пробата. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху същата проба, не трябва да превишава: - 15 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид от 30 до 100 mg/kg; - 15 mg/kg при съдържание на натриев лазалоцид от 100 до 200 mg/kg; - 7,5 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид над 200 mg/kg. 7.3. Извличане При обогатената проба храна за животни извличането трябва да бъде най-малко 80 %. При обогатените проби премикси извличането трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от паралелно изследване Проведено беше паралелно изследване 1, при което бяха анализирани 2 премикса (проби 1 и 2) и 5 храна за животни (проби 3 - 7) от 12 лаборатории. Върху всяка проба беше извършен двоен анализ. Резултатите са представени в следната таблица: ⟦⟦ ␟Проба 1␟Проба 2␟Проба 3␟Проба 4␟Проба 5␟Проба 6␟Проба 7 ␟Пилета␟Пуйки␟Пуйки␟Пилета␟Пуйки␟Домашни␟Домашни ␟Премикс␟Премикс␟Гранулиран␟Натрошен␟Храна за␟птици␟птици ␟␟␟␟␟животни␟Храна за␟Храна за ␟␟␟␟␟␟животни А␟животни В L␟12␟12␟12␟12␟12␟12␟12 N␟23␟23␟23␟23␟23␟23␟23 Средно␟␟␟␟␟␟␟ (mg/kg)␟5050␟16 200␟76,5␟78,4␟92,9␟48,3␟32,6 Sr (mg/kg)␟107␟408␟1,71␟2,23␟2,27␟1,93␟1,75 Cvr (%)␟2,12␟2,52␟2,24␟2,84␟2,44␟4,00␟5,37 SR (mg/kg)␟286␟883␟3,85␟7,32␟5,29␟3,47␟3,49 CVR (%)␟5,66␟5,45␟5,03␟9,34␟5,69␟7,18␟10,70 Номинално␟␟␟␟␟␟␟ съдържание␟␟␟␟␟␟␟ (mg/kg)␟5000*␟16 000*␟80*␟105*␟120*␟50+␟35+ ⟧⟧ L = брой лаборатории N = брой на отделните резултати Sr = стандартно отклонение на повторяемостта SR = стандартно отклонение на възпроизводимостта Cvr = коефициент на изменение на повторяемостта, % CVR = коефициент на изменение на възпроизводимостта, % * съдържание, декларирано от производителя + храна, приготвена в лабораторията 1 Analyst, 1995, 120, 2175-2180. L. Условия, които се прилагат при откриването, определянето или оценката на съставките от животински произход в храните за животни чрез микроскопски анализ 1. Цели и поле на приложение Настоящите условия се прилагат при откриването чрез микроскопски анализ на съставки от животински произход (определени като преработени продукти от трупове или части от бозайници, птици и риби) в храните за животни в рамките на програмата за координиран контрол в областта на храненето на животните съгласно Директива 95/53/ЕО на Съвета. Предвижда се, че методите, описани в настоящото приложение, се използват при всички официални изпитвания, може да бъде извършено и второ изпитване по производни или друг вид методи с цел усъвършенстване на откриването на някои типове съставки от животински произход или за определяне с по-голяма точност на произхода на съставките. Освен това за анализа на някои специфични съставки от животински произход, като плазмата или костите в салото (вж. също точка 9), може да се използва и различен протокол, при условие че тези анализи се провеждат в допълнение на анализите, предвидени в програмата за координирания контрол. 2. Чувствителност В зависимост от естеството на съставките от животински произход много малки количества могат да бъдат откривани в храните за животни (< 0,1 %). 3. Принцип За определянето се използва представителна проба, взета съгласно разпоредбите, определени в Директива 76/371/ЕИО на Комисията от 1 март 1976 г. относно определянето на методите на Общността за взимане на проби и за официалния контрол върху храните за животни2, пробата е надлежно подготвена за целта. Съставя се следният протокол за третирането на храни за животни с ниска влажност. Храните за животни с влажност над 14 % се изсушават (кондензират) преди третирането им. Някои храни за животни или някои суровини, предназначени за храни на животни (например мас и масла), изискват специално третиране (вж. точка 9). Съставките от животински произход се определят на базата на типични характеристики, които се установяват под микроскоп (а именно мускулни влакна и други части от месо, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, черупки от яйца, рибешки кости, люспи). Идентификацията се отнася както за пресятата фракция (6.1), така и за концентрираната утайка (6.2) на образеца. 4. Реактиви 4.1 Фиксатори 4.1.1. Хлоралхидрат (водонаситен до 60 % об. тегло) 2 ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 1. 4.1.2. Основа (2,5 % об. тегло NaOH или 2,5 % об. тегло KOH) за пресетите фракции 4.1.3. Парафиново масло или глицерол (вискозитет: 68-81) за микроскопски анализ на утайка 4.2. Промиващи средства 4.2.1. Спирт, 96 % 4.2.2. Ацетон 4.3. Концентриращи реактиви 4.3.1. Тетрахлоретилен (плътност 1,62) 4.4. Оцветяващ реагент 4.4.1. Йодиран разтвор/калиев йодид (да се разтворят 2 g калиев йодид в 100 ml вода и да се прибави 1 g йод, да се разклаща често) 4.4.2. Ализариново червено (да се разтворят 2,5 ml солна киселина 1М в 100 ml вода и към този разтвор да се прибавят 200 g ализариново червено) 4.4.3. Цистинов реактив (2 g оловен ацетат, 10 g NaOH на 100 ml Н2О) 4.4.4. Йодиран разтвор калиев йодид (етанол 70 % р-р) 4.5. Избелващ реагент 4.5.1. Готов разтвор на натриев хидрохлорид (9,6 % активен хлор) 5. Апаратура и помощни средства 5.1. Лабораторна везна (точност от 0,01 g, с изключение на концентрираната утайка: 0,001 g) 5.2. Инструмент за стриване (мелничка или хаванче, по-конкретно за животински продукти с мастно съдържание над 15 % към момента на анализа) 5.3. Сито с квадратни отвори с размер на отвора максимум 0,50 mm 5.4. Декантационна колба или бехерова чаша с конично дъно 5.5. Стереомикроскоп (увеличение най-малко 40 пъти) 5.6. Съставен микроскоп (увеличение най-малко 400 пъти) с излъчена или поляризирана светлина. 5.7. Стандартна лабораторна стъклария Цялото оборудване се почиства старателно. Декантационните колби и стъклария трябва да се измият машинно. Ситата се почистват с помощта на четка с твърд косъм. 6. Процедура Гранулираните храни могат да бъдат предварително пресети, ако двете фракции се анализират като отделни образци. Третират се най-малко 50 g от пробата (стрити старателно, ако е необходимо, с помощта на подходящ инструмент за смилане (5.2) с цел да се получи подходяща структура). От смления материал се вземат две представителни дози, едната за пресятата фракция (най-малко 5 g) (6.1), другата за концентрираната утайка (най-малко 5 g) (6.2). Оцветяването с реагенти (6.3) може да бъде използвано и за идентификационни цели. С цел да бъде показан видът на животинските протеини и произходът на частиците може да се използва помощно решаващо устройство, като например ARIES, както и еталонни проби. 6.1. Определяне на съставки от животински произход в пресетите фракции Най-малко 5 g от пробата трябва да се пресеят (5.3) в две фракции. Пресятата/тите фракция/и, съдържаща/и едрите частици (или представителна част от фракцията), се разстила върху съответния носител, така че да образува фин слой и методично се изследва под стереомикроскоп (5.5) при различни увеличения за откриване на съставките от животински произход. Предметните стъкла с препаратите на пресятата/ите фракция/и, които съдържат фини частици, се изследват методично под съставен микроскоп (5.6) при различни увеличения за откриване на съставките от животински произход. 6.2. Определяне на съставки от животински произход в концентрираната утайка Най-малко 5 g (точност от 0,01 g) от пробата се пресипват в декантационна колба или бехерова чаша с конично дъно и се обработват с най-малко 50 ml тетрахлоретилен (4.3.1). Сместа се разклаща или разбърква неколкократно. - Ако се използва затворена декантационна колба, сместа трябва да се остави да престои достатъчно дълго време, преди да се утаи (минимум три минути) и да се отдели утайката. Неколкократно се разклаща и се оставя отново да се утаи за минимум три минути, преди да се отдели отново утайката. - Ако се използва отворена бехерова чаша, сместа трябва да се остави да се утаи минимум 5 минути преди да се отдели утайката. Цялата утайка се изсушава и след това се претегля (точност от 0,001 g). Не се налага теглене, освен ако не се изисква количествена оценка. Ако утайката се състои от много едри частици, може да се пресее (5.3) в две фракции. Изсушената утайка се изследва със стереомикроскоп (5.5) и със съставен микроскоп (5.6) за установяване на съставки от кости. 6.3. Използване на фиксатори и оцветяващ реагент Идентифицирането чрез микроскоп на съставките от животински произход може да се улесни чрез използването на специални фиксатори и оцветители. ⟦⟦ Хлорал␟Чрез внимателно затопляне клетъчните структури могат да хидрат (4.1.1):␟бъдат виждани по-ясно, тъй като зърната нишесте желатинизират и нежеланото клетъчно съдържание се отстранява. Луга (4.1.2):␟Както натриевият хлорид, така и калиевият хлорид изчистват изследвания материал, като подпомагат откриването на мускулни влакна, косми и други кератинови структури. Парафиново␟Костните съставки могат да масло и гли-␟бъдат добре идентифицирани церол (4.1.3):␟в този запечатващ агент, тъй ␟като повечето кухини остават запълнени с въздух и се появяват като черни дупки с размери около 5 - 15 μm. Йодин/разтвор␟Използван за откриване на от калиев␟нишесте (синьо-виолетов цвят) йодид (4.4.1):␟и протеини (жълто-оранжев цвят). Разтворите могат да бъдат разредени, ако е необходимо. Червен␟Червено/розово оцветяване на кости, кости от риба и люспи. разтвор на ализарин (4.4.2):␟Преди изсушаване на утайката (виж раздел 6.2) цялата утайка се прехвърля в стъклена епруветка и се изплаква два пъти с приблизително 5 ml алкохол (4.2.1) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворителят се оставя да действа около една минута и се излива). Преди да се използва този оцветител, утайката се избелва, като се добавя най-малко 1 ml натриев хипохлоритен разтвор (4.5.1). Реакцията се оставя да продължи 10 минути. Епруветката се напълва с вода, утайката се оставя от две до три минути и водата и частиците, които са в състояние на суспензия, се изливат. Утайката се изплаква още два пъти с около 10 ml вода (следва да се използва вортекс миксер, оставя се да се утаи и водата се излива всеки път). Добавят се от 2 до 10 или повече капки (в зависимост от количеството на утайката) червен разтвор на ализарин. Сместа се разклаща и реакцията се осъществява за няколко секунди. Оцветената утайка се изплаква два пъти с приблизително 5 ml алкохол (4.2.1), последвани от едно изплакване с ацетон (4.2.2) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворът се оставя да се утаи за около една минута и течността се излива). След това утайката е готова за изсушаване. Реагент за␟Чрез внимателно загряване цистин (4.4.3)␟съставките, съдържащи цистин (козина, пера и т. н.), стават черно-кафяви. ⟧⟧ 6.4. Изследване на храните за животни, които биха могли да съдържат рибни брашна Под съставен микроскоп се изследва минимум едно предметно стъкло с препарат от пресята фина фракция и от фина фракция на утайка (виж раздели 6.1 и 6.2). Ако на етикета е посочено наличие на рибни брашна в съставките или ако има съмнение, или бъде открито наличие на рибни брашна при първоначалния преглед, се изследват най-малко две допълнителни предметни стъкла с препарати от пресята фина фракция на оригиналната проба и на фракция от общата утайка. 7. Изчисляване и оценка Държавите членки гарантират спазването на процедурите, описани по-нататък, при всеки официален анализ, целящ количествена оценка (не само наличие) на съставки от животински произход. Изчислението може да бъде направено само ако съставките от животински произход включват парчета от кости. Парчетата от кости от сухоземни топлокръвни видове животни (т.е. бозайниците и птиците) се различат от различните типове рибни кости върху микроскопско предметно стъкло по типичните лакуни (вдлъбнатини). Съотношението на отделните съставки от животински произход в пробата се изчислява, като се отчита: - разчетното съотношение (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход и - пропорцията (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход. Оценката трябва да се базира на изследването на най-малко три предметни стъкла (ако е възможно) и на най-малко пет полета за стъкло. В комбинираните храни за животни концентрираната утайка съдържа не само парчета от кости на сухоземни животни и рибни кости, но и други частици с високо специфично тегло, например минерали, пясък, части от вдървесени растения и др. 7.1. Разчетната стойност на процентното съдържание на парчета от кости Процентно съдържание на парчета кости от сухоземни видове = (S x c)/W Процентно съдържание на парчета от рибни кости и люспи = (S x d)/W (S = маса на утайката (mg), с = корекционен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни животни в утайката, d = корекционен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката, W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg). 7.2. Разчетната стойност на съставките от животински произход Пропорционалното участие на кости в продуктите от животински произход може да варира значително. (Процентното съдържание на кости е от порядъка на 50 до 60 % за костните брашна и от порядъка на 20 до 30 % за месните брашна; в случаите с рибени брашна съдържанието на кости и люспи варира в зависимост от категорията и произхода на рибеното брашно, но е в рамките обикновено на 10 до 20 %.) Ако се знае съдържанието на този тип брашно в пробата, възможно е да се направят следните оценки: Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на животинска основа от сухоземни животни (%) = (S x c)/(W x f) x 100 Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на рибена основа (%) = =(S x d)/(W x f) x 100 (S = маса на утайката (mg), с = корективен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни животни в утайката, d = корективен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката, f = корективен коефициент за съдържанието на кости в съставките от животински произход в разглеждания образец, W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg). 8. Излагане на резултата от изследването Отчетът съдържа най-малко информация относно наличието на съставки, производни от сухоземни животни и рибени брашна. Отделните случаи се представят по следния начин: 8.1. Що се отнася до наличието на съставки, производни от сухоземни животни: - в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп, или: - в разглежданата проба се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп. 8.2. Що се отнася до наличието на рибени брашна: - в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп, или: - в разглежданата проба се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени под микроскоп. Ако бъдат открити съставки, производни от риба или сухоземни животни, при необходимост отчетът от изследванията може да дава количествена оценка на откритите съставки (х %, < 0,1 %, между 0,1 и 0,5 %, между 0,5 и 5 % или > 5 %) и да уточнява типа сухоземни животни (ако е необходимо) и идентифицираните съставки от животински произход (мускулни влакна, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, яйчни черупки, кости от риба, люспи). Ако се прави количествена оценка на съставките от животински произход, то използваният корективен коефициент f също се упоменава. Когато се установи наличието на кости от сухоземни животни, в отчета се добавя и следната клауза: “Не се изключва възможността гореизброените съставки да произхождат от бозайници”. Тази допълнителна клауза не се изисква, ако парчетата кости на сухоземни животни са идентифицирани като парчета кости на птици или бозайници. 9. Незадължителен протокол от анализа на мас или масла При анализа на мас и масла може да се използва следният протокол: - За твърдата мас: тя трябва да се загрее до втечняването й, например в микровълнова печка. - Да се вземат с пипета 40 ml масти от дъното на пробата и да се накапят в центрофуга. - Да се центрофугира за 10 минути при 4000 оборота/минута. - Ако маста се втвърди при центрофугирането, да се загрее в печката, докато пак се върне в течно състояние. Да се центрофугира отново за 5 минути при 4000 оборота/минута. - С малка лъжичка или с шпатула половината от получените примеси се прехвърлят в малка чашка на Петри или върху микроскопско предметно стъкло с цел да се открие под микроскоп евентуалното наличие на съставки от животински произход (мускулни влакна, пера, парчета от кости и др.). Препоръчително е използването на парафиново олио или глицерол като запечатващ агент (фиксатор) за микроскопския анализ. - Остатъчните примеси се използват за подготвянето на утайката по начина, описан в точка 6.2. LI. Определяне съдържанието на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар 1. Цел и обхват Методът се използва за определяне съдържанието на спирамицин в храните за животни и предварително приготвените смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ррm)1. 2. Принцип Пробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при рН 8. Извлекът се декантира или центрофугира и разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията на спирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зони на инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е правопропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации. 3. Микроорганизъм: Microсоccus luteus АТСС 9341 (NCTC 834, NCIB 8553) 3.1. Поддържане на изходна култура В тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Microccus luteus и се слага в инкубатор за 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при около 4 °С. Слага се отново в инкубатор на всеки 2 седмици. 1 1 mg спирамицинова основа е еквивалентен на 3200 международни единици (UI) 3.2. Приготвяне на бактериалната суспензияа Взема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя в инкубатор за 18 - 20 часа при 30 °С. Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква. Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 nm в клетка 1 cm спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °С. 4. Културална среда и реактиви 4.1. Културална средаб ⟦⟦ Месен пептон␟6,0 g Триптон␟4,0 g Екстракт от дрожди␟3,0 g Месен екстракт␟1,5 g Глюкоза␟1,0 g Агар-агар␟10,0 до 20,0 g Вода␟1000 ml рН 6,5 до 6,6 (след␟ стерилизация).␟ ⟧⟧ 4.2. Културална среда за извършване на анализаб ⟦⟦ Триптон␟5,0 g Екстракт от дрожди␟4,0 g Месен екстракт␟3,0 g Агар-агар␟10,0 до 20,0 g Вода␟1000 ml рН 8,0 (след стерилизация).␟ ⟧⟧ 4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % ( w/v). Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml и се стерилизира. 4.4. Фосфатно-бикарбонатен буфер, рН 8,0 ⟦⟦ Двукалиев водороден␟ фосфат К2НРO4␟16,7 g Калиев двуводороден␟ фосфат КН2РO4␟0,5 g Натриев водороден␟ карбонат NaHCO3␟20,0 g Вода до␟1000 ml. ⟧⟧ 4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4) 50/50 (w/v). 4.6. Стандартна субстанция Спирамицин с известна активност (в IU). 5. Стандартни разтвори Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °С, този разтвор е стабилен до 5 дни. а Могат да бъдат използвани други методи, в случай че се установи, че при тях се получават сходни бактериални суспензии. б Може да се използва културална среда от търговски характер със сходен състав, даваща същите резултати. От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори: S8 1 IU/ml S4 0,5 IU/ml S2 0,25 IU/ml S1 0,125 IU/ml. 6. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ 6.1. Извличане Претегля се проба от 20 g при храни за животни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира и плаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8). За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg храна за животни, извличането се извършва, както следва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min; центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряват до около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40 °С. Остатъкът се разрежда със сместа (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8). 6.2. Разтвори за извършване на анализ От разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание 0,5 IU/ml), U2 (очаквано съдържание 0,25 IU/ml) и U1 (очаквано съдържание 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1+1) със сместа (4.5). 7. Процедура на извършване на анализа 7.1. Посяване на средата за изпитване В средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо да се получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин. 7.2. Подготовка на петритата Дифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2 и S1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита, достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит с алуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm. В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60 ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точно премерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32 зони на инхибиране. 7.3. Поставяне в инкубатор Петритата се поставят в инкубатор за 16 - 18 часа при температура 30 ± 2 °С. 8. Оценяване Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма на концентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствие на стандартния разтвор и екстракта. Определя се “най-точно съответстващата” точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използва формулата: 7S1 + 4S2 + S4 - S8 SL = ––––––––––––-----------. 10 Определя се “най-точно съответстващата” точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата: 7S8 + 4S4 + S2 - S1 SH = -----------------------------. 10 По подобен начин се изчисляват и “най-точно съответстващите” точки за най-ниските нива на екстракта (UL) и най-високите нива на екстракта (UH), като във формулите се заменят S1, S2, S4 и S8 с U1, U2, U4 и U82. Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да се получи линията на “най-точно съответствие” за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за да се получи линията на “най-точно съответствие” за екстракта. При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат да се считат паралелни, ако стойностите (SH - SL) и (UH - UL) не се различават с повече от 10% от тяхната средна аритметична стойност. Ако се окаже, че линиите не са паралелни, u1 и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да се изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на “най-точно съответствие”: 2 Малките букви “s” и “u” се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране. 5S1 + 2S2 - S4 5S2 + 2S4 - S8 а) SL = ---------------------- или ----------------------; 6 6 5S4 + 2S2 - S1 5S8 + 2S4 - S2 б) SH = ---------------------- или -----------------------, 6 6 и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет. Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (log A) посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка на успоредността. За четири нива - (U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8). 0,602 в) Log A = ------------------------------------------------------------------. U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 За три нива - (U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4). 0,401 г) Log A = ----------------------------------------------------, U4 + S4 - U1 - S1 или (U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8). 0,401 д) Log A = --------------------------------------------------. U8 + S8 - U2 - S2 Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по А: (U8=S8 x A). Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно - на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет. Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтaря. Ако пак не може да се получи успоредност, определянето се счита за незадоволително. Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg храна за животни. 9. Повторяемост Разликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия лаборант, не трябва да превишава: - 2 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg; - 20% от най-високата стойност - за съдържания от 10 до 25 mg/kg; - 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание от 25 до 50 mg/kg; - 10% от най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg. LII. Определяне на количеството влакнеста маса 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на органични субстанции без мазнини в храни, които са неразтворими в киселини и основи и са наричани конвенционално влакнеста маса. 2. Принцип Образецът, обезмаслен, когато е необходимо, се третира последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиев хидроокис с определени концентрации. Утайката се отделя чрез филтриране с помощта на филтър от синтеровано стъкло, след което се изпира, изсушава, претегля и изгаря до пепел при температури в диапазона от 475 до 500 °С. Намалението в теглото, получено в резултат на изгарянето до пепел, съответства на влакнестата маса, налична в изпитвания образец. 3. Реагенти 3.1. Сярна киселина, с = 0,13 mol/l. 3.2. Агент срещу образуване на пяна (например n-октанол). 3.3. Филтрираща маса (Селит 545 или еквивалент), загрята на температура 500 °С в продължение на четири часа (8.6). 3.4. Ацетон 3.5. Петролен етер с диапазон на кипене от 40 до 60 °С. 3.6. Солна киселина, с = 0,5 mol/l. 3.7. Разтвор на калиев хидроокис, с = 0,23 mol/l. 4. Уреди 4.1. Загряващо устройство за обработка със сярна киселина или с разтвор на калиев хидроокис, оборудвано с поставка за филтърния тигел (4.2) и снабдено с извеждаща тръба с кран към резервоар за течности и към вакуум. Възможно е да се използва сгъстен въздух. Преди използване всеки ден устройството се затопля с кипяща вода в продължение на пет минути. 4.2. Стъклен филтърен тигел с филтърна плоскост от синтеровано стъкло с филтърни пори с размер 40 - 90 μm. Преди първа употреба се загрява до 500 °С за няколко минути и се изстудява (8.6). 4.3. Цилиндър с обем най-малко 270 ml, снабден с обратен втечнител, подходящ за кипене. 4.4. Пещ за сушене с термостат. 4.5. Пещ за изпичане на порцелан с термостат. 4.6. Устройство за извличане, състоящо се от поддържаща плоскост за филтърния тигел (4.2), и с тръба за оттичане с кран към вакуум и към резервоар за течности. 4.7. Свързващи обръчи за монтаж на загряващото устройство (4.1), филтърния тигел (4.2) и цилиндъра (4.3) и за свързване на устройството за студено извличане (4.6) и тигела. 5. Процедура 1 g от подготвения образец се претегля с точност до най-близките 0,001 g и се поставя в тигела (4.2) (виж наблюдения 8.1, 8.2 и 8.3) и се добавя 1 g от филтриращата маса (3.3). Сглобяват се загряващото устройство (4.1) и филтърният тигел (4.2), след което към тигела се добавя цилиндърът. 150 ml от кипящата сярна киселина (3.1) се наливат в сглобените цилиндър и тигел и ако е необходимо, се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2). Течността се довежда до точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30 минути. Отваря се кранът към резервоара за течности (4.1) и при условия на вакуум сярната киселина се филтрира през филтърния тигел. Утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml кипяща вода, като при това утайката се изсушава след всяко изпиране. Кранът към резервоара за течности се затваря и в сглобените цилиндър и тигел се наливат 150 ml кипящ калиев хидроокис (3.7) и се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2). Течността се довежда до точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30 минути. Филтрира се и се повтаря процедурата по изпиране, използвана на етапа с използване на сярна киселина. След финалното изпиране и изсушаване тигелът и неговото съдържимо се отделят и се свързват отново към устройството за студено извличане (4.6). Прилага се вакуум и утайката се изпира в тигела с три последователни порции от по 25 ml ацетон (3.4), като при това тя се изсушава след всяко изпиране. Тигелът се изсушава до постоянно тегло в пещ при температура 130 °С. След всяко изсушаване съдържимото на тигела се изстудява в сушилня и бързо се претегля. Тигелът се поставя в пещ за изпичане на порцелан и неговото съдържимо се изгаря до пепел с постоянно тегло при температури в диапазона от 475 до 500 °С за най-малко 30 минути. След всяко загряване се изстудява първо пещта и след това сушилнята преди претегляне. Провежда се контролно изпитване без образеца. Загубата на тегло в резултат на изгарянето до пепел не трябва да превишава 4 mg. 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието на влакнеста маса е процент от образеца, получен по формулата: (b - c) x 100 Х = -----------------------, a където a = масата на образеца в g; b = загубата на маса след изгаряне до пепел по време на изпитването за определяне на количеството влакнеста маса, в g; c = загубата на маса след изгаряне до пепел след контролното изпитване, в g; 7. Повторимост Разликата между две паралелни определяния на количеството влакнеста маса, проведени върху един и същ образец, не трябва да надхвърля: - 0,3 по абсолютна стойност за съдържание на влакнеста маса под 10 %; - 3 % по отношение на най-високия резултат за съдържание на влакнеста маса, равно или по-голямо от 10 %. 8. Наблюдения 8.1. Храни, съдържащи повече от 10 % влакнеста маса, трябва да бъдат обезмаслени преди анализа с петролен етер (3.5). Филтърният тигел (4.2) и неговото съдържимо се свързват с устройството за студено извличане (4.6), прилага се вакуум и утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml петролен етер, като при това се осигурява утайката да е суха. Тигелът и неговото съдържимо се свързват към устройството за загряване (4.1) и се продължава, както е описано в т. 5. 8.2. Храни, съдържащи мазнини, които не могат да бъдат извлечени директно с петролен етер (3.5), трябва да бъдат обезмаслени, както е показано в т. 8.1, и още веднъж обезмаслени след кипене с киселина. След кипене с киселина и последващото изсушаване тигелът и неговото съдържимо се свързват към устройството за студено извличане (4.6) и се изпират три пъти с по 30 ml ацетон, последвани от три следващи изпирания с порции от по 30 ml петролен етер. Извършва се филтриране във вакуум до изсушаване и анализът се продължава, както е описано в т. 5, като се започва с обработка с калиев хидроокис. 8.3. Ако храните съдържат повече от 5 % карбонати, изразени в калциев карбонат, тигелът (4.2) с претегления образец се свързват към устройството за загряване (4.1). Образецът се изпира три пъти с по 30 ml солна киселина (3.6). След всяко добавяне образецът се оставя за около една минута преди филтриране. Изпира се веднъж с 30 ml вода и след това се продължава както е описано в т. 5. 8.4. Ако се използва уред във формата на стенд (няколко тигела, прикрепени към едно и също загряващо устройство), то две индивидуални определяния на един и същи образец за анализ не могат да бъдат направени в една и съща серия. 8.5. Ако след кипене е трудно да се филтрират киселини и основи, използва се сгъстен въздух през тръбата за оттичане на загряващото устройство и след това филтрирането продължава. 8.6. Температурата на изгарянето до пепел не трябва да бъде по-висока от 500 °С, за да се удължи животът на стъклените филтърни тигели. Трябва да се внимава да не се предизвика температурен шок по време на циклите на загряване и изстудяване. LIII. Насоки за оценка на някои продукти, използвани при храненето на животните Общи аспекти Настоящите насоки представляват наръчник, предназначен за изготвянето на документация за продуктите, изброени в точки 1.1 и 1.2 от Приложението към Директива 82/471/ЕИО, получени от култивиране на микроорганизми и за които има вероятност да бъдат допуснати като нов източник на протеини при храненето на животните. Чрез тази документация следва да се направи оценка на въпросните продукти въз основа на настоящото състояние на познанията и следва да гарантират тяхното съответствие с фундаменталните принципи, определени с цел допускане на тяхната употреба, които са предмет на член 6, параграф 2 от гореупоменатата директива. Могат да бъдат поискани всички изследвания, очертани в този документ, и при необходимост да се поиска допълнителна информация. Като общо правило трябва да се осигури цялата информация, необходима за установяване идентичността на микроорганизма и състава на културната среда, както и производствения процес, характеристиката, представянето, условията на употреба, методите за определяне и хранителните свойства на продукта. Същото важи за информацията, необходима за оценяване на допустимото ниво на продукта посредством целевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които пряко или непряко произтичат от използването на продукта. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, зависят от естеството на продукта, съответните животински видове и метаболизма на продукта в лабораторните животни. Документацията, която следва да се предостави, трябва да включва подробни доклади, представени в съответния ред и с номерирането, предложени тези насоки и придружена от резюме. Липсата на което и да е от предложените изследвания трябва да бъде аргументирана. Прилагат се публикациите, цитирани като препратки. Наблюдения Терминът “продукт”, така както се използва в настоящите насоки, се отнася за който и да е съдържащ протеини продукт - в състоянието, в което той ще се представя като храна за животни или като компонент от храна за животни. При всяка промяна в производствения процес или в условията за употреба на продукта ще се изисква уведомяване и при необходимост допълнителна документация за нова оценка. Представяне на изследванията I.Микроорганизъм, културна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и условия на употреба, методи на определяне II. Изследвания за хранителните свойства на продукта III. Изследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животните IV. Други подходящи изследвания Раздел I Микроорганизъм, хранителна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и условия на употреба, методи на определяне 1. Микроорганизъм 1.1. Класификация, произход, морфология, биологични свойства, генетични манипулации. 1.2. Безвредност, възможно оцеляване извън ферментора и последици за околната среда. 1.3. Устойчивост и чистота на култивираните щамове, методи, използвани за проверка на тези критерии. 2. Културна среда и производствен процес 2.1. Състав на субстрата, добавени субстанции и т. н. 2.2. Процеси на производство, изсушаване и очистване. Процес на умъртвяване на микроорганизмите. Методи, използвани за проверка константността на състава на култивирания продукт и откриване на всякакви химически, физически и биологични замърсители по време на производството. 2.3. Технически процеси на подготовка за употреба. 3. Характеристики на продукта 3.1. Физически и физико-химични свойства: макро- и микроморфология, размер на частиците, плътност, специфично тегло, хигроскопичност, разтворимост, електростатични свойства и т. н. 3.2. Химически състав и характеристики 3.2.1. Съдържание на влага, груб протеин, груби масти, груба целулоза, груба пепел, въглехидрати, граници за вариране на тези съдържания. 3.2.2. Съдържание на общия амоняк, амин, нитрат и нитритен нитроген, нуклеинови киселини, протеин, количествен и качествен състав на общите и на свободните аминокиселини и на пириновите и пиримидиновите бази. 3.2.3. Количествен и качествен състав на общите липиди: мастни киселини, несапунообразуваща материя, разтворими в липиди пигменти, фосфолипиди. 3.2.4. Състав на въглехидратната фракция. 3.2.5. Количествен и качествен състав на неорганичните компоненти. 3.2.6. Количествен и качествен състав на витамините. 3.2.7. Количествен и качествен състав на другите съставки: добавки, остатъци от субстрата и разтворителите, други потенциално вредни остатъци от метаболизма на субстрата, на културната среда, на производствения процес. 3.3. Микробиологично замърсяване на продукта. 3.4. Поведение и стабилност на продукта - като такъв и когато е смесен с храни в текуща употреба, по време на съхранението му. 4. Представяне и условия на употреба 4.1. Предложени имена за търговия на продукта. 4.2. Предложени формули за търговия на продукта. 4.3. Планирана употреба на продукта при храненето на животните. Планирани концентрации в пълноценни фуражи и в планираните количества за дневните дажби за съответните животински видове. 5. Методи на определяне Количествени и качествени методи за определяне на продукта в комплектни и в допълващи храни. NB Описанието на тези методи се придружава от информация относно специфичност, чувствителност, граници на откриване, граници на грешка, възможни намеси от страна на други субстанции. Трябва да има представени мостри от продукта в неговите различни предложени представяния. Раздел II Изследвания за хранителните свойства на продукта 1. Оценка на протеиновата стойност 1.1. Химични, биохимични и микробиологични изследвания. 1.2. Изследвания върху лабораторни животни, сравнени с оглед протеините. 2. Изследвания върху целеви видове За всеки целеви вид трябва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества от протеинов азот, за преживни животни с общ азот. 2.1. Протеин и стойност на енергийната добавка на продукта в дажбите съгласно предложените условия на употреба при различните физиологични стадии (например в периода на растеж, бременност, люпене). 2.2. Влиянието на продукта при предложените условия на употреба върху степента на растеж, степен на усвояване на храната, заболеваемост, смъртност. 2.3. Оптимални хранителни нива на включване на продукта в дажбите. 2.4. Ефектът на продукта при предложените условия на употреба върху технологичните, органолептичните или другите качества на ядливите продукти с животински произход. 3. Експериментални условия в изследванията върху целевите видове Да се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни: 3.1. Вид, подвид, възраст и пол на животните, процедура за идентификация. 3.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е достатъчно голям за статистически анализ с използване на подходящи статистически параметри). 3.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ. 3.4. Местоположение на всеки експеримент, физиологично състояние и условия за здравето на животните, условия за отглеждане (последните трябва да отразяват тези условия, които се използват на практика в Общността). 3.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведения анализ. Раздел III Изследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животните Изследванията, очертани в този раздел, са предназначени да позволят оценка на безопасността при употребата на продукта в целевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които биха могли да се получат пряко или косвено от тази употреба. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, ще зависят от естеството на продукта, от съответния животински вид и метаболизма на продукта в лабораторните животни. 1. Изследвания върху целеви видове За всеки целеви вид следва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества от протеинов азот, за преживни животни с общ азот. 1.1. Максимални степени на включване на продукта в дневната дажба, без при това да се създава неблагоприятен ефект. 1.2. Възможният ефект от продукта върху плодородието и възпроизводството по целесъобразност. 1.3. Ефектите от консумацията на продукта при предложените условия на употреба на микроорганизмите във флората на хранопровода и върху колонизацията на патогенни микроорганизми в хранопровода. 1.4. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в ядливите продукти от животински произход. 1.5. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в екскрементите. 2. Изследвания върху лабораторни животни 2.1. Метаболизъм Съдбата на продукта в животното: усвояване, натрупване, биологично превръщане, елиминиране. 2.2. Мутагенност Проучване на потенциалната мутагенност поради замърсители (по-специално микотоксини и бактерии) или остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители), включително в тестовете със скрининг ин витро, като се използват системи за активиране на метаболизма. 2.3. Токсикологични изследвания Долупосочените изследвания трябва да се направят в сравнение с контролни групи, получавайки - при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества протеинов азот. Трябва да се изследват токсичните ефекти, така че да се осветли тяхната причина и механизмите и да се гарантира, че те не се получават в резултат на хранителния дисбаланс или от свръхдоза на продукта в диетата. 2.3.1. Субхронична токсичност (поне 90 дни) Най-общо тези изследвания трябва да се проведат върху два животински вида, като единият от тях е гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване. Тези нива трябва да бъдат избрани по такъв начин, че да се определи, ако е възможно, нивото на липса на ефект и ниво, което да показва известен неблагоприятен ефект. Групите животни трябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. При опита винаги трябва да се включва една контролна група. Всички релевантни биологични данни трябва да бъдат записвани на подходящи интервали от време, особено данните за степента на растеж, консумацията на храна, хематологията, анализът на урината, биохимичните параметри, смъртността, теглото на органите, общата патология и хистопатология на основните органи и тъкани. Резултатите трябва да се представят в детайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка. 2.3.2. Хронична токсичност Най-общо изследванията за хронична токсичност трябва да се проведат върху два животински вида, като единият от тях е гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване. Експериментите трябва да продължат поне две години при плъхове или 80 седмици при мишки. Групите животни трябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. При опита винаги трябва да се включва една контролна група. За предпочитане е биологичните изследвания, посочени в точка 2.3.1, да се проведат върху малка сателитна група от животни (една група, разделена от и зависима от основната група) на подходящи интервали от време през време на целия експеримент и върху преживелите животни в края на експеримента. 2.3.3. Канцерогенност За оценката на канцерогенност трябва да се обърне особено внимание на времето на появата, хистологичните типове на всякакви наблюдавани тумори и тяхната повторяемост. Всеки ефект върху повторяемостта на туморите и/или повторяемостта или напредъка на заболяванията трябва да се оценяват с препратка към контролните групи, така както е посочено в параграф 2.3. Резултатите трябва да се представят в детайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка. 2.4. Други изследвания Изследванията за възпроизводство трябва да обхващат поне две дъщерни поколения и могат да бъдат комбинирани с изследвания за ембриотоксичност, включително и тератогеничност. Специално внимание трябва да се обърне на плодовитостта, продуктивността и на наблюденията върху следродовото развитие на поколенията. Може да се предвиди и всякакъв друг метод, който е научно аргументиран и за който е вероятно да доведе до измерими резултати (например “relay toxicity”). 2.5. Експериментални условия в изследванията върху лабораторните животни Да се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни: 2.5.1. Вид, подвид, щам и пол на животните, процедура на идентификация. 2.5.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е достатъчно голям за статистически анализ, като се използват подходящи статистически параметри). 2.5.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ. 2.5.4. Общи условия за научна подкрепа през време на целия период на тестване. 2.5.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведеното изследване. 2.5.6. Процент и разпределение на смъртността във всяка партида. 2.5.7. Клинични симптоми и патологични изменения, възникнали по време на експеримента и момента на появата им. 3. Изследвания, свързани с околната среда Според естеството на възможните остатъци (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в изпражненията на целевите видове могат да бъдат изискани данни за промяната на тези остатъци в торовете, почвите, водите, както и за ефекта им върху биологичния състав на почвата, растителността и водните организми. Раздел IV Други подходящи изследвания Според естеството и условията на употреба на продукта могат да бъдат изискани данни, свързани с алергията, раздразнението на кожата, очните, дихателните или хранителните лигавици, за да се направи оценка на потенциалните рискове по време на обработката на продукта и те да бъдат предотвратени. LIV. Метод за изчисление на енергийната стойност на храните за домашни птици 1. Метод за изчисление и формула на енергийната стойност Енергийната стойност на комбинираните храни за домашни птици трябва да бъде изчислявана в съответствие с посочената по-долу формула въз основа на процентното съдържание на определените за анализ хранителни компоненти. Тази стойност трябва да бъде изразена в мегаджаули (MJ) обменна енергия (ОЕ), отделен азот на килограм от хранителната смес: MJ/kg ОЕ = 0,1551 Ч % суров протеин + 0,3431 Ч % сурови мазнини + 0,1669 Ч % скорбяла + 0,1301 Ч % общо захари (изразени като захароза). 2. Допустими отклонения от декларираните стойности Ако официалната проверка, предвидена в член 12, установи несъответствие (повишена или занижена енергийна стойност на храната за животни) между резултата от проверката и декларираната енергийна стойност, се допуска минимално отклонение от 0,4 MJ/kg ОЕ. 3. Израз на резултата След прилагането на гореизложената формула полученият резултат трябва да бъде отчетен до първия знак след десетичната запетая. 4. Методи за вземане на проби и анализ Вземането на проби от комбинираната храна и определянето на съдържанието на компонентите за анализ, посочени в метода за изчисление, трябва да бъде извършено в съответствие с общностните методи за вземане на проби или в съответствие с методите за анализ, използвани при официалния контрол на храните за животни.:

1. Храни, които непосредствено подлежат на смилане Ако не е предвидено друго в методите за анализ, цялата проба се пресява през сито с квадратни отвори с размер 1 mm2 (в съответствие с препоръчките на ISO R565) след смилането ѝ, ако това е необходимо. Желателно е да се избягва прекалено ситното смилане. Пресятата проба се разбърква и се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се отново, преди да се отдели предназначеното за анализ количество.

2. Храни, които подлежат на смилане след изсушаване Ако не е предвидено друго в методите за анализ, пробата се изсушава, докато съдържанието на влага е от порядъка 8 – 12% в съответствие с предварителната процедура за изсушаване, описана в начина за установяване на водното съдържание, след което се прилага т. 1.

3. Течни или полутечни храни Пробата се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се добре непосредствено преди отделяне на предназначеното за анализ количество.

4. Други храни Пробите, които не могат да се приготвят чрез една от описаните процедури, се обработват чрез всяка друга процедура, която гарантира, че отделените за анализиране количества са хомогенни и представителни за окончателната проба.

5. Съхраняване на пробите Пробите се съхраняват при температура, която не променя техния състав. Пробите, предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни към светлината, се съхраняват в съдове от кафяво стъкло. Б. Реактиви и апаратура, използвани при методите за анализ

1-dup. Ако не е предвидено друго в методите за анализ, всички аналитични реактиви трябва да бъдат аналитично чисти (ан.ч.). При изследване за остатъчни елементи чистотата на реактивите се установява посредством специален тест. В зависимост от получените резултати може да се изисква допълнително пречистване на реактивите.

2-dup. При всяка посочена в аналитичните методи процедура, включваща подготовката на разтвори, разреждане, изплакване или измиване, без да се посочва естеството на използвания разтворител или разредител, се предполага, че трябва да се използва вода. Като общо правило водата трябва да бъде деминерализирана или дестилирана. В някои конкретни случаи, посочени в методите за анализ, тя трябва да се подложи на специални процедури или пречистване.

3-dup. По отношение на обичайното оборудване в контролните лаборатории само специалните или изискващите специална употреба инструменти или апаратура се посочват в аналитичните методи. Те трябва да бъдат чисти, особено в случаите, когато се изследва наличието на вещества в много малки количества. В. Прилагане на методите за анализ и отразяване на резултатите

1-dup2. По принцип се възприема един метод за анализ на всяко вещество в храните за животни. Ако са възприети няколко различни метода, използваният от контролната лаборатория конкретен метод трябва да бъде посочен в отчета на резултатите от анализа.

2-dup2. Посоченият в отчета резултат от анализа трябва да представлява средна стойност, получена от минимум две процедури по установяване на вещества, при извършването на които са използвани две различни части на пробата с достатъчна повторяемост. Според регламентирания в метода за анализ начин този резултат се изразява чрез съответния брой значими цифри, като при необходимост се коригира спрямо водното съдържание на окончателната проба преди подготовката. МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ

I. Метод за определяне на циановодородна киселина

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на циановодородната киселина, свободна и свързана под формата на гликозиди, в храни за животни и в частност в продукти, производни на ленено семе, брашно от маниока и някои видове бобови култури.

2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Циановодородната киселина се освобождава под действие на ензими, увлича се чрез парна дестилация и се събира в определен обем подкислен разтвор на сребърен нитрат. Сребърният цианид се разделя чрез филтруване и излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат.

3. Реактиви

4. Апаратура

5. Процедура Претеглят се 20 g от пробата с точност до 5 ml, поставят се в 1-литрова плоскодънна колба и се добавят 50 ml вода и 10 ml суспензия от сладки бадеми (3.1). Колбата се запушва и се поставя в сушилня при 38°C за 16 h. След това се охлажда до стайна температура и се добавят 80 ml вода, 10 ml разтвор на натриев ацетат (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Колбата се свързва към апарат за парна дестилация и се поставя в маслена баня, предварително доведена до температура малко над 100 °C. Дестилират се 200 до 300 ml течност, като се пуска мощен поток пара през колбата и внимателно се загрява маслената баня. Дестилатът се събира в ерленмайерова колба, защитена от светлината и съдържаща точно 50 ml 0,02 N (3.5) разтвор на сребърен нитрат и 1 ml азотна киселина (3.4). Необходимо е да се внимава краят на удължителя на хладника да е потопен в разтвора сребърен нитрат. Съдържанието се прехвърля на ерленмайеровата колба в 500 ml мерителна колба, допълва се с вода, разбърква се и се филтрува. Вземат се 250 ml от филтрата, добавят се около 1 ml разтвор на амониев ферисулфат (3.7) и се титрува обратно излишният сребърен нитрат с 0,02 N (3.6) разтвор на амониев тиоцианат от градуираната на 1/20 ml бюрета. Ако е необходимо, може да се направи празна проба чрез същата процедура, приложена към 10 ml суспензия на сладки бадеми (3.1), като пробата не се анализира.

6. Изчисляване на резултатите Ако празната проба покаже, че е бил погълнат 0,02N разтвор на сребърен нитрат, стойността на този обем се изважда от обема, погълнат от дестилата на пробата. 1 ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат отговаря на 0,54 mg HCN. Резултатът се изразява като процент за пробата.

7. Наблюдение Ако пробата съдържа голямо количество сулфиди (напр. бобови култури), се образува черна утайка от сребърен сулфид, който се филтрува заедно с утайката от сребърен цианид. Образуването на тази утайка води до загуба на 0,02N сребърен нитрат, чийто обем трябва да се извади от обема, използван за изчисляването на съдържанието HCN. За тази цел: Утайката се обработва върху филтъра с 50 ml амониев хидрооксис (3.8), за да се разтвори сребърният цианид. Остатъкът се промива с разреден амониев хидрооксис и след това се определя сребърното му съдържание. Получената стойност се преобразува в ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат. Съдържанието HCN на пробата може да се определи и чрез титруване на подкисления амонячен филтрат с азотна киселина.

II. Метод за определяне на калций

1. Цел и обхват Методът дава възможност да се определи общото съдържание на калций в храни за животни.

2. Принцип Калцият се опепелява, пепелта се обработва със солна киселина и калцият се утаява като калциев оксалат. Утайката се разтваря в сярна киселина и се титрува оксаловата киселина, която се получава с разтвор на калиев перманганат.

3. Реактиви

4. Апаратура

5. Процедура 5 g от пробата или повече се претеглят (ако е необходимо) с точност до mg, като се накалява при 550 °C и се прехвърля пепелта в 250 mg бехерова чаша. Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), 60 ml вода и няколко капки азотна киселина (3.2). Довежда се до кипене и се задържа при температурата на кипене в продължение на тридесет минути. Охлажда се и разтворът се прехвърля в 250 ml мерителна колба. Промива се, обемът се довежда до мярката с вода, хомогенизира се и се филтрува. С помощта на пипета се прехвърля в 250 ml бехерова чаша аликвотна част, съдържаща 10 до 40 mg калций според предполагаемото калциево съдържание. Добавя се 1 ml разтвор на лимонена киселина (3.6) и 5 ml амониев хлорид (3.7). Обемът трябва да бъде до приблизително 100 ml с вода. Довежда се до кипене, добавя се 8 – 10 капки разтвор на бром-крезол зелено (3.8) и 30 ml горещ разтвор на амониев оксалат (3.5). Ако се получи утайка, тя се разтваря, като се добавят няколко капки солна киселина (3.1). Неутрализира се много бавно с амониев хидрооксис (3.4), като се бърка непрекъснато, докато pH стане 4,4 до 4,6, т.е. когато индикаторът смени цвета си. Бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се изчакват 30 min, така че образуваната утайка да падне на дъното. Бехеровата чаша се изважда от водната баня. Оставя се да престои един час и се филтрува през филтърен тигел G4. Бехеровата чаша и тигелът се промиват с вода до пълно отстраняване на излишния амониев оксалат (липсата на хлориди в промивните води показва, че промиването е достатъчно). Утайката се разтваря върху филтъра в 50 ml гореща сярна киселина (3.3). Тигелът се промива с гореща вода и филтратът се довежда до около 100 ml. Нагрява се до 70 – 80 °C и се титрува на капки с разтвор на калиев перманганат (3.9), докато се появи розово оцветяване, което се задържа една минута.

6. Изчисляване на резултатите 1 ml калиев перманганат 0,1N отговаря на 2,004 mg калций. Полученият резултат се изразява като процент за пробата.

7. Наблюдения

III. Метод за определяне на карбонати

1. Цел и обхват Методът позволява определяне на количеството карбонати, които обикновено се изразяват като калциев карбонат, в повечето храни за животни. В някои случаи обаче (напр. с железен карбонат) трябва да се използва специален метод.

2. Принцип Карбонатите се разлагат в солна киселина; освободеният въглероден двуокис се събира в градуирана тръба и обемът му се сравнява с този, освободен при същите условия от познато количество калциев карбонат А.Р.

3. Реактиви

4. Апаратура Апарат Шайблер-Дитрих (вж. схемата) или равностоен на него

5. Процедура В зависимост от съдържанието карбонати в пробата част от пробата се претегля, както е посочено: – 0,5 g за продукти, съдържащи от 50 до 100% карбонати, изразени като калциев карбонат; – 1 g за продукти, съдържащи от 40 до 50% карбонати, изразени като калциев карбонат; – 2 до 3 g за други продукти. Частта от пробата се поставя в специалната колба 4 на апарата, снабдена с малка тръбичка от нетрошлив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (3.1), и колбата се свързва с апарата. Трипътният кран се завърта 5, така че тръбата 1 да се свързва откъм външната страна. Като се използва подвижната тръба 2, която е пълна с оцветена сярна киселина (3.3) и свързана към градуираната тръба 1, нивото на течността се довежда до нулевата марка. Кранът 5 се завърта, така че тръбите 1 и 3 да се свържат. Необходимо е да се провери дали нивото е на нула. Солната киселина (3.1) се довежда бавно върху частта от пробата, като се накланя колбата 4. Налягането се изравнява, като тръбата 2 се сваля надолу. Колбата 4 се бълника дотогава, докато престане напълно отделянето на въглероден двуокис. Налягането се възстановява, като се въвежда течността отново до едно и също ниво в тръби 1 и 2. След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането. Необходимо е да се направи контролна проба при същите условия с 0,5 g калциев карбонат (3.2).

6. Изчисляване на резултатите Съдържанието в грамове карбонати, изразено като % калциев карбонат в пробата, се изчислява по формулата: \frac{V.100}{T.2W} където: V e ml CO2, отделено на порция от пробата; T – ml CO2, отделено при 0,5g CaCO3 А.Р.; W – теглото на порцията от пробата, в грамове.

7. Наблюдения

IV. Метод за определяне на сурова пепел

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на сурова пепел в храни за животни.

2. Принцип Пробата се накалява при 550 °C; остатъкът се претегля.

3. Реактиви 20% разтвор (w/v) на амониев нитрат

4. Апаратура

5. Процедура Около 5 g от пробата (2,5 при продукти, които имат склонност да набъват) се претеглят с точност до mg и се поставят в тигел за накаляване, който е бил предварително накален и тариран. Тигелът се поставя върху нагревателна плоча и се нагрява постепенно, докато субстанцията се овъгли. Тигелът се поставя в муфелна пещ, нагласена на 550^{\circ}\text{C} \pm 50^{\circ}\text{C}. Задържа се при тази температура дотогава, докато се получи бяла, светлосива или червеникава пепел, която изглежда свободна от карбонатсъдържащи частици. Тигелът се поставя в ексикатор, оставя се да се охлади и се претегля незабавно.

6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като се извади тарираното тегло. Резултатът се изразява като процент за пробата.

7. Наблюдения

V. Метод за определяне на пепел, която е неразтворима в солна киселина

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на количеството минерални субстанции, неразтворими в солна киселина, в храни за животни. В зависимост от естеството на пробата могат да се приложат два метода:

2. Принцип

3. Реактиви

4. Апаратура

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като тарираното тегло се изважда. Резултатът се изразява в проценти за пробата.

7. Наблюдение Ако филтруването се окаже трудно, за подновяване на анализа 50-те ml солна киселина 3N (3.1) се заместват с 50 ml 20% трихлороцетна киселина (3.2) и филтърът се промива с горещ 1 % разтвор на трихлороцетна киселина (3.3).

VI. Метод за определяне на хлор от хлориди

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието хлор в хлориди, които са разтворими във вода, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим към всички храни за животни.

2. Принцип Хлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се избистря. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата на сребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард.

3. Реактиви:

4. Апаратура клатачна машина (Шутел): прибл. 35 до 40 оборота в min.

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите Количеството хлор (w), изразено като натриев хлорид, налично в обема на филтрата, взет за титруване, се изчислява по следната формула: W = 5,845 (V_1 - V_2) \text{ mg}, където: V_1 е добавеният разтвор на сребърен нитрат C,1 N, ml; V_2 – разтворът на амониев тиоцианат 0,1N, използван за титруване, ml. Ако празната проба показва, че разтворът на сребърен нитрат 0,1N е изчерпан, тази стойност се приспада от обема (V_1 - V_2).

7. Наблюдения

VII. Метод за определяне на горчично масло

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието горчично масло в кейкове от brassica и sinapis видовете и в съставни храни, които съдържат кейкове, приготвени от тези видове, изразено като алил изотиоцианат, който може да бъде уловен с пара.

2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Горчичното масло се освобождава под действието на ензими, улавя се чрез дестилация с етанол и се събира в разреден амоняк. Разтворът се обработва на горещо с определен обем сребърен нитрат, след което се охлажда и филтрува. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат.

3. Реактиви

4. Апаратура:

5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до mg, поставят се в 500 ml плоскодънна колба и се добавят 2 g фино смлян бял синап (3.1) (източник на ензим) и 200 ml вода с температура 20°C. Колбата се запушва и се държи при температура 20°C около 2 h, като често се разклаща. Добавят се 40 ml етанол (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Дестилират се около 150 ml и се събира дестилатът в 250 ml мерителна колба, съдържаща 20 ml амониев хидрооксид (3.4), като се внимава краят на хладника да е потопен в течността. Добавят се към амонячния разтвор 50 ml 0,1N разтвор на сребърен нитрат (3.5) (или повече, ако се налага). Поставя се малка фунийка върху мерителната колба и сместа се нагрява на кипяща водна баня един час. Оставя се да се охлади, допълва се до марката с вода, разбърква се и се филтрува. Изваждат се 100 ml от бистрия филтрат, добавят се 5 ml азотна киселина (3.7) и около 5 ml амониев ферисулфат (3.8). Титрува се излишният сребърен нитрат с 0,1N разтвор на амониев тиоцианат (3.6). Прави се празна проба по същата процедура с 2 g фино смлян бял синап, без пробата за анализ.

6. Изчисляване на резултатите Обемът 0,1N сребърен нитрат се изважда, поет от празната проба, от обема, поет от пробата. Получената стойност дава броя ml сребърен нитрат 0,1N, поет от горчичното масло в пробата. 1 ml AgNO3 0,1N отговаря на 4,956 mg алил изотиоцианат. Резултатът се извежда като проценти за пробата.

VIII. Метод за определяне на лактоза

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието лактоза в храни за животни, съдържащи повече от 0,5% лактоза.

2. Принцип Захарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под действие на saccharomyces cerevisiae, които дрожди не засягат лактозата. След избистряне и филтруване съдържанието лактоза във филтрата се определя по метода Луф-Шорл.

3. Реактиви:

4. Апаратура Водна баня с термостат, нагласен на 3 – 40°C

5. Процедура Претегля се 1 g от пробата с точност до mg и се поставя тази порция от пробата в 100 ml мерителна колба. Добавят се 25 до 30 ml вода. Поставя се колбата в кипяща водна баня за 30 min и след това се охлажда до приблизително 35°C. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (3.1) и се хомогенизира. Оставя се колбата да престои 2 h на водна баня при температура 38 – 40 °C. Охлажда се до около 20 °C. Добавят се 2,5 ml разтвор Карез I (3.2), бърка се 30 sec, след това се добавят 2,5 ml разтвор Карез II (3.3) и отново се бърка 30 sec. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и се филтрува. С помощта на пипета се взема част от филтрата – не повече от 25 ml и за предпочитане със съдържание на лактоза от 40 до 80 ml – и се прехвърля в 300 ml ерленмайерова колба. Ако е необходимо, допълва се до 25 ml с вода. Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1). Съдържанието на лактоза по метода на Луф-Шорл се определя, както следва: прибавят се точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (3.5). Бърка се на ръка, докато се нагрява на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху телена мрежа с отвор около 6 cm в диаметър, покрита с азбест, под която е запален пламък. Пламъкът се регулира така, че да се нагрява само основата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина 6N (3.7); титрува се с разтвор на натриев тиосулфат 0,1N (3.8) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (3.9) и се завършва титруването. Извършва се същото титруване с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и 25 ml сярна киселина 6N (3.7) без кипене.

6. Изчисляване на резултатите На базата на приложената таблица се определя количеството лактоза в mg, което съответства на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml на тиосулфатен разтвор 0,1 N. Резултатът се изразява като части от дехидратирана лактоза в процент от пробата.

7. Наблюдения За продукти, съдържащи повече от 40% ферментируема захар, се използват повече от 5 ml дрождена суспензия (3.1). Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O} Глюкоза, фруктоза, инвертни захари \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 Лактоза \text{C}_{12}\text{H}_{22}\text{O}_{11} Малтоза \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O} mg разлика mg разлика mg разлика ml ml ml ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 80,0 94,6 23

IX. Метод за определяне на калий

1. Цел и обхват Този метод позволява определяне на количеството калий в храни за животни.

2. Принцип Пробата се накалява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции до голяма степен елиминира преченето от примесващи се елементи.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура:

6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата.

7. Наблюдения За да се елиминира влиянието на примесващи елементи, невинаги се налага да се прибавя пълнител (3.5).

X. Метод за определяне на натрий

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието натрий в храни за животни.

2. Принцип Пробата се опепелява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции в голяма степен елиминира влиянието на примесни елементи.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура:

6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата.

7. Наблюдения: 7.1.3a продукти, съдържащи повече от 4% натрий, е за предпочитане да се опепели субстанцията за 2 h в тигел с капак. След охлаждане се добавя вода, пепелта се превръща в суспензия с помощта на платиново телче, изсушава се и се опепелява отново за 2 h в тигела с капак.

XI. Метод за определяне на захар

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия, изразени като глюкоза или, когато е подходящо, като захараза, преобразувано с коефициент 0,95. Той е приложим към съставни храни за животни. За другите храни за животни са предвидени специални методи. Когато се налага, лактозата трябва да се измерва отделно и да се отчита при изчисляването на резултатите.

2. Принцип Захарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл.

3. Реактиви:

4. Апаратура: Миксер (барабан) – приблизително 35 до 40 оборота в min.

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите С помощта на таблицата се установява количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между стойностите на двете титрувания, изразена в mg натриев тиосулфат 0,1N. Резултатът се изразява като процент за пробата.

7. Специални процедури

8. Наблюдения

XII. Метод за определяне на карбамид

1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието карбамид в храни за животни.

2. Принцип Пробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрува. Съдържанието карбамид във филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичната плътност при дължина на вълната 420 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите Количеството карбамид в пробата се определя, като се използва калибриращата крива. Резултатът се изразява в проценти за пробата.

7. Наблюдения

XIII. Изчисляване на уреазната активност на продукти, производни на соята

1. Цел и обхват Анализът позволява да се изчисли уреазната активност на продукти, производни на соята, и да се провери дали тези продукти са били обработени достатъчно добре.

2. Принцип Уреазната активност се изчислява чрез количеството амонячен азот, освободено от 1 g продукт за минута при 30^\circ\text{C} от разтвор на карбамид.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура Около 10 g от пробата се смилат (напр. в мелничка за кафе) така, че да преминават през сито с отвори 0,2 mm. Претеглят се 0,2 g от смляната проба с точност до mg, поставят се в епруветка със стъклена запушалка с шлиф и се добавят 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Запушва се веднага и енергично се разклаща. Епруветката се поставя на водна баня, нагласена точно на 30°C, и се разклаща енергично. Епруветката се поставя на водна баня, точно на 30°C и се задръжа там 30 min. Веднага се добавят 10 ml от 0,1N солна киселина (3.1), охлажда се бързо до 20°C и съдържанието на епруветката се прехвърля количествено в съд за титруване, като се промива два пъти с по 5 ml вода. С помощта на стъклен електрод (4.1) се титрува веднага до pH 4,7 с 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) чрез електрометрия. Празна проба се приготвя, както следва: Проба от 0,2 g, претеглена с точност до mg, се поставя бързо в епруветка със стъклена запушалка с шлиф, добавят се 10 ml 0,1N солна киселина (3.1) и след това 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Епруветката се охлажда веднага в ледена вода и се оставя в нея 30 min. При тези условия се извършва прехвърляне на съдържанието на епруветката в съда за титруване, като се използва 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) до pH 4,7.

6. Изчисление: Уреазната активност се изчислява по формулата 1 ml от 0,1 N \text{NaOH} = 18\text{ mg} теобромин.

7. Наблюдение:

XIV. Метод за определяне на суров протеин

1. Цел и обхват: Чрез този метод може въз основа на съдържанието на азот, измерен по метода на Kjeldahl, да се определи съдържанието на суровия протеин в продукти за изхранване на животни.

2. Принцип: Пробата се разлага чрез мокро изгаряне. Киселият разтвор се неутрализира с разтвор на натриева основа. Отделеният амоняк се улавя чрез дестилация и се събира в известно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува с разтвор на натриева основа.

3. Реактиви:

4. Апаратура: апаратура за разлагане на пробата чрез изгаряне и за дестилиране по метода на Kjeldahl (виж наблюдение 7.1).

5. Процедура:

6. Пресмятане на резултатите Определя се обемът на използваната сярна киселина. Един ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост. Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,2 като абсолютна стойност – при съдържание на суров протеин, по-малко от 20%; • 1,0% като относителна стойност – при съдържание не по-малко от 20% и не по-голямо от 40%; • 0,4 като абсолютна стойност – при съдържание повече от 40%.

7. Наблюдения.

XV. Метод за определяне на влага

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определя съдържанието на влага в храните за животни. Той не обхваща анализа на млечни продукти, използвани като директни храни за животни, анализа на минерални субстанции и смеси, съставени преобладаващо от минерални вещества, анализа на животински и растителни мазнини и масла или анализа на маслодайни семена и маслодайни плодове.

2. Принцип Пробата се изсушава при точно определени условия, които варират в съответствие с характера на храните за животни. Загубата на маса се определя чрез претегляне. Необходимо е да се извърши предварително изсушаване, когато се работи с твърди храни за животни с високо съдържание на влага.

3. Апарати:

4. Процедура Описаните операции се извършват веднага след отварянето на пакетите с пробите. Анализът се извършва най-малко два пъти.

5. Калкулиране на резултатите Съдържанието на влага като процент на пробата се изчислява чрез използване на следните формули:

6. Наблюдение Ако се докаже, че раздробяването е необходимо и ако се види, че това намалява съдържанието на влага в продукта, резултатите от анализа на компонентите на храната за животни трябва да бъдат коригирани на базата на съдържанието на влага на пробата в нейното начално състояние.

XVI. Метод за определяне на амоняк (volatile nitrogenous bases) А. МИКРОДИФУЗИЯ

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, проявяващи се като амоняк (ammonia), в храните за животните.

2. Принцип Пробата се екстрахира с вода и разтворът се избистря и филтрира. Амонякът се измества чрез микродифузия, използвайки разтвор на калиев карбонат, събран в разтвор от борна киселина, и се титрува със сярна киселина.

3. Реактиви:

4. Апарати:

5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставят със 100 ml вода в една градуирана колба от 200 ml. Разбърква се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до нужния обем с вода, енергично се разклаща и се филтрира през един нагънат филтър / pleated filter. Използва се пипета, внася се 1 ml разтвор на борна киселина (3.3) в централната част на клетката на Конвей и 1 ml от филтрата на пробата във външната камера на чашката (crown of the cell). Покрива се частично със смазания капак. Капва се 1 ml разтвор на наситен калиев карбонат (3.4) бързо в чашката и капакът се затваря, така че чашката да е херметично затворена. Разклаща се внимателно чашката на Конуей хоризонтално, така че двата реактива да се смесят. Оставя се да действа (incubate) или за наймалко 4 h при стайна температура, или за 1 h при 40°C. Използва се градуирана колба (4.3), летливите основи се титруват в разтвор от борова киселина със сярна киселина 0,02 N (3.5). Прави се бланков тест (празен тест), като се прилага същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана.

6. Калкулиране на резултатите 1 ml от \text{H}_2\text{SO}_4 0,02 N отговаря на 0,34 mg от амоняк. Резултатите се изразяват като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не следва да надвишават: 10 %, в относителна стойност/value – при съдържание на амоняк, по-малко от 1,0%; 0,1 %, в абсолютна стойност – при съдържание на амоняк 1,0 % или повече.

7. Наблюдение Ако съдържанието на амоняк в пробата превишава 0,76 %, началният филтрат се разрежда. Б. ЧРЕЗ ДЕСТИЛАЦИЯ

1-dup. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на амоняк (volatile nitrogenous bases), проявяващи се като амоняк, рибно брашно, несъдържащо практически урея. Той е приложим само при съдържание на амоняк, по-малко от 0,25 %.

2-dup. Принцип Пробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрува. Амонякът са отделя при точката на кипене чрез добавяне на магнезиев окис и се събира в точно определено количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува остатъчно с разтвор на натриев хидроокис (sodium hydroxide).

3-dup. Реактиви:

4-dup. Апаратура:

5-dup. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставя с 100 ml вода в градуирана колба от 200 ml. Смесва се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до обема с вода, разклаща се енергично и се филтрира през нагънат филтър. Взема се едно количество от чист филтрат, подходящо за предполагаемото съдържание на летливи азотни основи (100 ml обикновено са достатъчни). Разрежда се до 200 ml и се добавят 2 g магнезиев окис (3.2) и няколко капки от емулсия против пяна (3.3). Разтворът би трябвало да е алкален към лакмусова хартия, в противен случай се добавя малко магнезиев окис (3.2). Дестилират се около 150 ml от разтвора в апарата на Kjeldahl и дестилатът се събира в една колба на Erlenmaйer (Erlenmeyer), съдържаща точно измерен обем (25 до 50 ml) от сярна киселина 0,1 N (3.4). Докато се извършва дестилацията, се избягва претоплянето на страните. Разтворът на сярната киселина се кипва за 2 min, охлажда се и излишъкът от сярна киселина се титрува обратно с разтвор на натриев хидроокис 0,1 N (3.5) в присъствието на метил рот като индикатор (methyl red indicator) (3.6). Извършва се празен тест, като се следва същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана.

6-dup. Калкулиране на резултатите 1 ml \text{H}_2\text{SO}_4 0,1 N съответствува на 1,7 mg амоняк. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би следвало да надхвърля в относителна стойност (relative value) 10 % амоняк.

XVII. Метод за определяне общото съдържание на фосфор ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на общ фосфор в храните за животни. Той е особено подходящ за анализа на нискофосфорни продукти. В определени случаи (продукти, богати на фосфор) може да бъде използван гравиметричен метод.

2. Принцип Пробата се минерализира или чрез сухо горене (при органични храни за животни), или чрез киселинно смилане (при минерални комбинирани или течни храни за животни), поставена в киселинен разтвор. Разтворът се третира с молибдованадиев (molybdovanadate) реактив. Оптическата плътност на така образувания жълт разтвор се измерва в спектрофотометър (spectra-photometer) при 430 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Калкулиране на резултатите Количеството на фосфора в пробата за тест се определя чрез използване кривата на калибриране. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би трябвало да надвишава 3 % в относителна стойност – при фосфорно съдържание, по-малко от 5 %; 0,15 %, в абсолютна стойност – при фосфорно съдържание от 5 % или повече.

XVIII. Метод за определяне на сурови масла и мазнини

1. Задача и обхват Това е метод за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в животинските храни. Той не обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла. Използването на описаните процедури, зависи от характера и състава на животинските храни и повода за извършване на анализа.

2. Принцип

3. Реактиви

4. Апаратура

5. Процедура

6. Изразяване на резултатите Теглото на остатъка се изразява като процент от пробата. Повторяемост 1 Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания. Разликата между две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не трябва да превишава: – 2% в абсолютна стойност – за съдържание на сурови масла и мазнини, по-ниско от 5 %; – 4 % в абсолютна стойност спрямо най-високия резултат – за съдържание от 5 до 10 %; – 0,4 % в абсолютна стойност – за съдържание над 10 %.

7. Забележки

XIX. Метод за определяне на аминокиселини

1. Цел и област на приложение Настоящият метод е за определяне на свободните (синтетични и естествени) аминокиселини и общите (пептидно свързани и свободни) аминокиселини в животински храни, като се използва анализатор на аминокиселини. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспартитова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолеуцин, леуцин, фенилаланин, пролин, серин, тирозин и валин. Методът не разграничава солите на аминокиселините и не може да диференцира D и L формите на аминокиселините. Той не е валиден за определяне на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселини.

2. Принцип

3. Реактиви Използва се бидестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < 10 \muS).

4. Апаратура

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите Площта на пиковете на пробата и еталона се измерва за всяка отделна аминокиселина и се изчислява количеството в g аминокиселина на kg проба. A.E.MW.F \text{-----} = g B.W.1000 аминокиселина на kg мостра. Ако се използва вътрешен еталон, се умножава с D/C. А е пиковата площ, хидролизат или екстракт; В – пиковата площ, калибриращ еталонен разтвор; С – пиковата площ, вътрешен еталон хидролизат или екстракт; D – пиковата площ, вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор; MW – молекулното тегло на определяната аминокиселина; E – концентрацията на еталона в \mu\text{mol/ml}; W - теглото на пробата g (коригирано до оригиналното тегло, ако е сушено или са отстранени мазнините); F e ml общото съдържание на хидролизат (5.3.4) или ml изчислен общ обем на разтваряне на екстракта (6.1). Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в хидролизатите на окислената проба, но се изчисляват като цистин (\text{C}_6\text{H}_{12}\text{N}_2\text{O}_4\text{S}_2 молекулно тегло 240,30 чрез използване молекулно тегло 120,15 (= 0,5 \times 240,30)). Метионинът се определя като метионин сулфон в хидролизати на окислени проби, но се изчислява като метионин, като се използва молекулното тегло на метионина 149,21. Добавеният свободен метионин се определя след извличането като метионин, като за изчислението се използва същото молекулно тегло.

7. Оценка на метода Методът е тестван чрез сравняване на резултатите на международно ниво през 1990 г., като са използвани четири различни животински храни (смесена храна за прасета, компаунд за бройлери, белтъчен концентрат, предварително приготвени смеси). Резултатите, след елиминиране на стойностите, рязко отличаващи се от нормалните, на средноаритметичното и стандартното отклонение са дадени в таблицата: Средни аритметични стойности в g/kg Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Компаунд за бройлери 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Белтъчен концентрат 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Предварително приготвена смеска 59,42 n = 16 - 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = брой участващи лаборатории.

8. Използване на референтните материали Правилното прилагане на метода се проверява чрез извършване на повтарящи измервания на сертифицирани референтни материали, когато има такива на разположение. Препоръчва се калибриране със сертифицирани калибрирани разтвори на аминокиселини.

9. Забележки

XX. Определяне на олахиндокс (2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил)-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид)

1. Цел и обхват Това е метод за определяне на олахиндокс в животински храни. Долната граница на определяне е 5 mg/kg.

2. Принцип Пробата се извлича със смес вода-метанол. Съдържанието на олахиндокс се определя с висококачествен течен хроматограф обратна фаза (HPLC), като се използва УВ детектор.

3. Реактиви:

1-dup. метанол;

2-dup. метанол с качество HPLC;

3-dup. вода с качество HPLC;

4. мобилна фаза за HPLC; смес вода (3.3) – метанол (3.2), 900 + 100 (V + V).

3.5. Еталонна субстанция: чист олахиндокс (2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил)-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид), E 851;

4-dup. Апаратура:

5. Процедура Забележка. Олахиндоксът е чувствителен към светлината. Всички операции се извършват при разсеяна светлина или се използват тъмнокафяви стъкленици.

6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс на разтвора се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието на олахиндокс в пробата се определя със следната формула: w = \frac{c.1000}{m} в която: w е съдържанието в mg/kg; c – концентрацията на олахиндокс в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml; m – масата на изпитваната част в g (5.2).

7. Установяване на достоверността на резултатите

8. Резултати от съвместното изследване При провеждане на съвместно изследване, при което 4 мостри на храни за прасенца, включително една празна проба, са анализирани в 13 лаборатории, се получават резултатите, дадени в таблицата: Мостра 1 Мостра 2 Мостра 3 Мостра 4 L 13 10 11 11 n 40 40 44 44 Средноаритметична стойност (mg/kg) - 14,6 48,0 95,4 S_t (mg/kg) - 0,82 2,05 6,36 S_R (mg/kg) - 1,62 4,28 8,42 CV_t (%) - 5,6 4,3 6,7 CV_R (%) - 11,1 8,9 8,8 Номинално съдържание (mg/kg) - 15 50 100 Възстановяване (%) - 97,3 96,0 95,4 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на възпроизводимост; S_t – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_t – коефициент на вариации на възпроизводимост; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост.

9. Забележка Въпреки че методът не е утвърден за храни, съдържащи повече от 100 mg/kg олахиндокс, могат да бъдат получени задоволителни резултати, като се използва по-малка проба за анализ и/или като се разреди екстрактът (5.2), така че да се постигне концентрация в рамките на калибриращата графика (5.3.2).

XXI. Методи за определяне на нишесте ПОЛАРИМЕТРИЧЕН МЕТОД

1. Цел и обхват Чрез този метод може да се определи нивото на нишестето и високомолекулните продукти от неговото разграждане в продуктите за изхранване на животни, с изключение на онези от тях, които съдържат цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изсушена горна част на цвеклото и листата, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (например резенки и брашно от земна ябълка).

2. Принцип Методът включва две определяния. В първото пробата се обработва докато е гореща с разредена солна киселина. След избистряне и филтруване се определя въртенето на поляризираната светлина от разтвора чрез поляриметрия. Във второто пробата се екстрахира с 40% етанол. След подкисляване със солна киселина, избистряне и филтруване въртенето на поляризираната светлина се измерва както в първото определяне. Разликата между двете измервания, умножено по известен коефициент, дава количеството на нишестето в пробата.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на нишесте в проценти се изчислява по следната формула:

7. Наблюдения

XXII. Определяне на общото количество суров белтък

1. Цел и обхват – методът дава възможност да се определи общото количество суров белтък в хранителните вещества на базата на азотно съдържание, определяно по метода на Kjeldahl.

2. Принцип – пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Серният рартвор се алкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в мерно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид.

3. Реагенти:

4. Апарат – подходящ за кипене, дестилация и титрация, по процедурата на Кйелдал.

5. Процедура

6. Калкулиране на резултатите Съдържанието на общото количество белтък се извършва по следната формула: (V_0 \cdot V_1) \cdot c = 0,014 \cdot 100 \cdot 6,25 \cdot t, където: V_0 е обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в теста с контролната проба; V_1 – обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в титрацията на пробата; c – концентрацията (mol/l) на натриев хидроксид (3.9 или 3.10); t – масата [g] на пробата.

7. Сверяване, поверка на метода

8. Наблюдение

XXIII. Определяне на суров протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи фракцията на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина при определени условия. Той е приложим при всички продукти за изхранване на животни.

2. Принцип Пробата се нагрява в продължение на 48 h при 40°C в разтвор на пепсин хидрохлорид. Суспенсията се филтрува и съдържанието на азот във филтрата се определя по метода за определяне на суров протеин.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Обемът на сярната киселина, използвана при празната проба, се изважда от обема, използван при изследваната проба. 1 ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,4 като абсолютна стойност, при съдържание по-малко от 20%; • 2,0% като относителна стойност, при съдържание не по-малко от 20% и не повече от 40%; • 0,8 като абсолютна стойност, при съдържание повече от 40%.

7. Наблюдения

XXIV. Определяне активността на пепсин

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи активността на пепсина, който се използва при определяне на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина.

2. Принцип Хемоглобинът се обработва при определени условия с пепсин в среда, съдържаща солна киселина. Нехидролизираната фракция на протеина се преципитира с трихлороцетна киселина. Към филтрата се прибавят натриева основа и реактив на Folin-Ciocalteu. Оптичната плътност на разтвора се измерва при 750 nm и количеството на тирозина се определя по калибровъчна крива. Определение – за единица пепсин се приема това количество от този ензим, което в условията на метода освобождава за 1 min такова количество хидроксиарилни групи, които, оцветени с реактива на Folin-Ciocalteu, имат оптична плътност, съответстваща на оптичната плътност на 1 µmol тирозин, оцветен по същия начин.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Преслиятане на резултатите От калибриращата крива се отчита количеството на тирозин в mol, съответстващо на оптическата гъстота на цветния разтвор, коригиран на основа на празната проба. Активността на пепсина в mol на тирозина при 25^\circ\text{C} на mg за min се изчислява при следната формула: \text{Свързване в mg (U/mg)} = \frac{0,32a}{p}, където: a е количеството тирозин в mol, отчетено на калибриращата крива; p – теглото в mg на количеството пепсин, посочено в 5.2.

7. Наблюдения

XXV. Определяне на свободен и общ госипол

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят нивото на свободния госипол, общият госипол и химически сродните субстанции в памучно семе, брашно от памучно семе, в кюспе от памучно семе и в комбинирани продукти за изхранване на животни, съдържащи тези субстанции, когато концентрацията надвишава 20 ppm.

2. Принцип Свободният госипол се определя чрез екстракция в присъствие на 3-аминопропан-1-ол или със смес от пропан-2-ол и хексан. Общият госипол се определя чрез екстракция с диметилформамид. Чрез анилин госиполът се превръща в госипол-дианилин, чиято оптическа плътност се измерва при 440 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Резултатите могат да се изчислят или на база специфичната оптическа плътност (6.1), или на калибрираната крива (6.2). 6.1 На база специфичната оптическа плътност Специфичните оптически плътности при описаните условия ще бъдат: \begin{aligned} & 1\% \\ \text{свободен госипол} - E &= \frac{625}{1\text{cm}} , \\ \text{общ госипол} - E &= \frac{600}{1\text{cm}} . \end{aligned} Съдържанието на свободен или общ госипол на пробата се изчислява по формулата: \begin{aligned} & 1250 \text{ E} \\ \% \text{ госипол} &= \frac{1\%}{\text{E} \text{ — PA}} , \\ & 1\text{cm} \end{aligned} където: Е е коригираната оптическа плътност, определна съгласно 5.2; P – пробата за тест в g; A – аликвотната част от филтрата в ml.

XXVI. Определяне на тилозин чрез дифузия в агар

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на тилозина в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm.

2. Принцип Пробата се обработва с разтвор на фосфатен буфер pH 8, след което се екстрахира с метанол. След центрофугиране екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на тилозина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика.

3. Микроорганизъм – Sarcina lutea, АТСС № 9341

4. Хранителна среда и реактиви

5. Стандартни разтвори Стандартната субстанция (4.8) се суши в продължение на 3 h при 60°C във вакуумна сушилня (5 mm Hg стълб). Претеглят се от 10 до 50 mg в мерителна колба, разтварят в 5 ml метанол (4.5) и се разрежда с разтвора на фосфатния буфер, pH 7 (4.3), така че да се получи основна концентрация на тилозина 1000 \mu\text{g/ml}. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.7) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 2 \mu\text{g/ml} тилозин – основа. Като се използва сместа (4.7), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: \text{S}_4 – 1 \mu\text{g/ml}; \text{S}_2 – 0,5 \mu\text{g/ml}; \text{S}_1 – 0,25 \mu\text{g/ml}.

6. Екстракция За концентратите се взема проба от 10 g; за премиксите и за продуктите за изхранване на животни – 20 g. Добавят се 60 ml разтвор на фосфатен буфер pH 8 (4.2), предварително нагрят до 80°C, и се хомогенизира в продължение на 2 min (домашен миксер, Ultra-turrax и др.). Оставя се в продължение на 10 min, добавят се 40 ml метанол и се хомогенизира в продължение на 5 min. Екстрактът се центрофугира, аликвотна част се разрежда със сместа (4.7), за да се получи предполагаема концентрация на тилозина 2 \mu\text{g/ml} (= \text{U}_8). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.7), се приготвят концентрациите \text{U}_4, \text{U}_2 и \text{U}_1. При съдържание по-малко от 10 ppm екстрактът се изпарява до сухо на ротационен изпарител при 35°C и остатъкът се разтваря в 40%-ен метанол (4.6).

7. Метод за определяне

8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полулогаритмична хартия, като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (\text{U}_1 + \text{U}_2 + \text{U}_4 + \text{U}_8 - \text{S}_1 - \text{S}_2 - \text{S}_4 - \text{S}_8) 0,602 \text{U}_4 + \text{U}_8 + \text{S}_4 + \text{S}_8 - \text{U}_1 - \text{U}_2 - \text{S}_1 - \text{S}_2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност.

9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават 10% като относителна стойност.

XXVII. Определяне на виржиниамицин чрез дифузия в агар

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на виржиниамицин в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm.

2. Принцип Пробата се екстрахира с Tween80 – метанолов разтвор. След центрофугиране и филтруване екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на виржиниамицина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика.

3. Микроорганизъм – Sarcina lutea, АТСС № 9341

4. Хранителна среда и реактиви

5. Стандартни разтвори Приготвя се метанолов разтвор на стандартната субстанция (4.7), съдържащ 800 µg/ml виржиниамицин. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.5) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 1 µg/ml виржиниамицин. Като се използва сместа (4.5), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: S4 – 0,5 µg/ml; S2 – 0,25 µg/ml; S1 – 0,125 µg/ml.

6. Екстракция

7. Метод за определяне

8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полу-логаритмична хартия като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) = 0,602 U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност.

9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишава 10% като относителна стойност.

XXVIII. Определяне на влага в животински и растителни мазнини и масла

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят водата и летливите субстанции, съдъжащи се в животински и растителни мазнини и масла.

2. Принцип Пробата се изсушава до постоянно тегло при 103°C. Загубата на маса се определя чрез претегляне.

3. Апаратура:

4. Процедура В сухото тарирано блюдо (3.1), в което е поставен термометърът (3.2), се претеглят с точност до 1 mg около 20 g от хомогенизираната проба. Нагрява се върху пясъчната баня или котлона (3.3), като се разбърква непрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90°C за около 7 min. Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното на блюдото. Температурата не трябва да надвишава 105°C. Като се продължава разбъркването, се изстъргва дъното на блюдото, докато престанат да се образуват мехури. За да се осигури напълно отстраняване на влагата нагряването се повтаря няколко пъти до 103 ± 2°C с охлаждане до 93°C между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (3.4) и се претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на маса между две последователни претегляния не надвишава 2 mg. Забележка: Увеличаването на масата на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване на мазнината. В този случай резултатът се пресмята от претеглянето, проведено непосредствено преди масата да започне да нараства.

5. Пресмятане на резултата Съдържанието на влага като процент от пробата се дава от следната формула: \frac{(M_1 - M_2) 100}{M_0}, където: M_0 е масата на изследваната проба, в g; M_1 – масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, преди сушене, в g; M_2 – масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, след сушене, в g. Резултати, по-ниски от 0,05%, трябва да се записват като „по-ниско от 0,05%“. Повторяемост Разликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05% като абсолютна стойност.

XXIX. Определяне на магнезий чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия

1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи количеството на магнезий в продукти за изхранване на животни. В частност той е подходящ за определяне съдържания на магнезий, по-ниски от 5%.

2. Принцип Пробата се опепелява и се разтваря в разредена солна киселина. Ако пробата не съдържа органични субстанции, тя се разтваря директно в разредена солна киселина. Разтворът се разрежда и съдържанието на магнезий се определя чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия с дължина на вълната 285,2 nm при сравняване със стандартни разтвори.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Количеството на магнезия в пробата се пресмята по отношение на сравнителните разтвори. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 5% в относителна стойност.

XXX. Определяне на сурови влакнини

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне в продукти за изхранване на животни количеството на органичните субстанции, които не съдържат мазнини и са неразтворими в кисели и алкални среди. Обикновено те се означават като сурови влакнини.

2. Принцип Пробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиева основа с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтруване в присъствие на азбест, измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при 900°C. Загубата на тегло в резултат на опепеляването отговаря на грубото влакно, присъстващо в изследваната проба.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура В бехерова чаша (4.1) се претеглят с точност до 1 mg 3 g от пробата и 2 g обработен азбест (3.2), добавят се 200 ml сярна киселина (3.1) и няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.3). Нагрява се бавно до завиране и се оставя да се вари точно 30 min. За да се запази постоянен обемът, бехеровата чаша се покрива с приспособление за охлаждане, като например облодънна колба от 500 ml, в която циркулира студена вода. Кипенето се прекратява чрез добавяне на около 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се промива с пет порции от по приблизително 100 ml много гореща вода така, че да се получи краен обем на филтрата 800 ml. Остатъкът се пренася количествено в бехеровата чаша (4.1), в която предварително е бил поставен порцелановият диск за регулиране на кипенето (4.2). Добавят се 200 ml разтвор на калиева основа (3.4). Нагрява се до кипене и се оставя да се вари точно 30 min. Добавят се приблизително 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през свеж азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се мие с много гореща вода, докато промивната вода стане неутрална (изпитва се с лакмусова хартия), и след това три пъти с ацетон (3.6) (общо около 100 ml ацетон). Остатъкът се пренася количествено в тигел за изгаряне (4.5), като, ако е необходимо, се натрошава, и се суши до постоянно тегло в сушилния шкаф при 130°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Тигелът се поставя в муфелната пещ (4.6) и се накалява за 30 min при 900°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Празната проба се провежда, като се приложи същата процедура към обработения азбест (3.2), но без пробата. Загубата на тегло в резултат от накаляването на 6 g азбест не трябва да надвишава 10 mg.

6. Пресиятане на резултатите Съдържанието на грубо влакно като процент от пробата се дава от отношението: \frac{(a - b) 100}{3}, където: a е загубата на тегло след накаляване на пробата; b – загубата на тегло след накаляване на празната проба. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишават: 0,3 като абсолютна стойност, за съдържание на грубо влакно по-малко от 10%; 3% като относителна стойност, за съдържание на грубо влакно, равно или по-голямо от 10%.

7. Наблюдения

XXXI. Определяне на нишесте чрез панкреатичен метод

1. Цел и област на приложение Методът дава възможност за определяне съдържанието на нишесте и на високомолекулните продукти от разграждане на нишестето в продуктите за изхранване на животни, съдържащи цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изрезки от сушена горна част на цвеклото или листа, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (напр. резанки и брашно от земна ябълка), и продукти, съдържащи пръжки. Определянията се провеждат само когато микроскопското изследване покаже, че в пробата има значителни количества нишесте.

2. Принцип Захарите, присъстващи в пробата, се екстрахират с етанол. Нишестето в екстрахирания остатък се разгражда до захар с панкреатин. Образуваните захари се хидролизират със солна киселина и получената глюкоза се определя по метода на Luff-Schoorl. Така полученото количество глюкоза, умножено по постоянен коефициент, дава съдържанието на нишесте в пробата.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Като се използва таблицата в приложението, се определя количеството глюкоза в mg, отговарящо на разликите в резултатите от двете титрувания (изразени като ml 0,1 N натриев тиосулфат) и отнасящи се както до пробата за анализ, така и до празната проба. Съдържанието на нишесте, като процент от пробата, се дава от формулата: 0,72 (A – B), където: A е глюкозата, отнасяща се до пробата за анализ, в mg; B – глюкозата, отнасяща се до празната проба (виж наблюдение 7.2), в mg.

7. Наблюдения

8. Указания, отнасящи се за панкреатина: външен вид; жълтеникавобял аморфен прах; съдържание на глюкоза – количеството на глюкоза в празната проба (виж 5.5) нормално е 0,25 mg. Резултат, по-голям от 0,50 mg, показва, че панкреатинът не може повече да бъде използван. Проверка за свързване на йод: Суспендират се 62,5 mg панкреатин в около 50 ml вода, нагрята до около 25 – 30°C. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Разбърква се 2 min. Титрува се с 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат в присъствие на нишестен индикатор. Свързването на йодния разтвор от панкреатина не трябва да надвишава 0,5 ml. Проверка за амилолитична активност. Смесват се 100 ml разтвор на нишесте (3.18), 5 ml буферен разтвор (3.4), 0,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 62,5 mg панкреатин. Сместа се нагрява до 25 – 30°C и се разбърква за 2 min. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Синьото оцветяване от добавянето на разтвора на йод трябва да изчезне в продължение на не повече от 15 min. Таблица на значенията за 25 ml реактив на Luff-Schoorl ml 0,1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6 Глюкоза, фруктоза, инвертни захари Лактоза Малтоза 0,1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6 mg разлика mg разлика C6H12O6 Mr Ml mg разлика mg разлика Mr разлика Ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 3,1 80,0 4,1 94,6 4,6 23

XXXII. Определяне на ампролиум 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид

1. Цел и обхват Това е метод за определяне на ампролиум в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване 1 mg/kg, границата на определяне 25 mg/kg.

2. Принцип Пробата се извлича със смес метанол - вода. След разтваряне с мобилната фаза и мембранна филтрация, съдържанието на ампролиум се определя с помощта на висококачествена течна хроматография катионен обмен (HPLC), използваща УВ детектор.

3. Реагенти:

4. Апарати:

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площ) на пиковете на ампролиум на разтвора се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието на ампролиум w в mg/kg в пробата се дава със следната формула: w = \frac{V.b.f}{m} [mg/kg], където: V е обемът на екстракционния разтворител (3.8) в ml в съответствие с т. 5.2 (т.е. 200 ml); b – концентрацията на ампролиум в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml; f – коефициент на разреждане съгласно т. 5.2; m – масата на изпитваната част в g (5.2).

7. Установяване на достоверността на резултатите

8. Резултати от съвместното изследване При провеждане на изследване и анализиране на три мостри храни за птици (проби 1 – 3), една минерална храна (проба 4) и предварително приготвена смес (проба 5) се постигат следните резултати: Проба1 Проба2 Проба3 Проба4 Проба5 L 14 14 14 14 15 n 56 56 56 56 60 Mean [mg/kg] - 45=5 188 5129 25 140 SR - 2,26 3,57 178 550 CVR[%] - 4,95 1,90 3,46 2,20 sf: - 2,95 11,8 266 760 CVf[%]: - 6,47 6,27 5,19 3,00 Номинално съдържание [mg/kg] - 50 200 5000 25 000 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; sf: – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVf: – коефициент на вариации на възпроизводимост.

9. Забележки

XXXIII. Определяне на етопабат (метил-4-ацетамидо-2-етоксибензоат)

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на етопабат в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 2 ppm.

2. Принцип Пробата се екстрахира с разреден метанол. Разтворът се подкислява и екстрахира с хлороформ. Хлороформният екстракт се промива първо с алкален разтвор и след това с вода. Пречистеният екстракт се концентрира, етопабатът се хидролизира с разредена солна киселина. Образуваното по този начин аминопроизводно се диазотира и куплира с 2-аминоетил-1-нафтиламин. Цветният комплекс се екстрахира с бутанол и оптическата плътност на разтвора се измерва при 555 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултати Съдържанието на етопабат в mg на килограм проба се дава от формулата: (EA - EB) / (EC - EB) \cdot 80/W, където: EA е оптическата плътност на разтвора от пробата; EB – оптическа плътност на разтвора от контролния тест; EC – оптическа плътност на разтвора от стандартния тест; W – теглото на порцията за изследване в грамове.

7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 20%, като относителна стойност – за съдържание на етопабат под 7,5 ppm; • 1,5 ppm, като абсолютна стойност, за съдържание между 7,7 и 10 ppm; • 15%, като относителна стойност, за съдържание над 10 ppm.

XXXIV. Определяне на динитолмид (ДОТ) (3,5-динитро-о-толуамид)

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на динитолмид (ДОТ) в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Нитрофуранови производни могат да пречат. Долната граница на определянето е 40 ppm.

2. Принцип Пробата се екстрахира с ацетонитрил. Екстрактът се пречиства върху алуминиев окис и се филтрува. Аликвота от филтрата се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря в диметилформамид и се обработва с етилендиамин, с който образува пурпурен комплекс. Динитолмидът се определя спектрофотометрично при 560 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на динитолмид в mg/kg проба се получава по формулата: (EB - EA) / (EC - EB) * F / W * 1000, където: EA е оптическата плътност на разтвор A (празна проба); EB – оптическата плътност на разтвор B (проба за анализиране); EC – оптическата плътност на разтвор C (вътрешен стандарт); W – теглото на порцията за изследване в грамове; F – коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1).

7. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишават: • 10 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание на динитолмид под 100 ppm; • 10%, като относителна стойност – за съдържание между 100 и 5000 ppm; • 500 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 5000 и 10 000 ppm; • 5%, като относителна стойност – за съдържание над 10 000 ppm.

XXXV. Определяне на никарбазин (еквимолекулярна смес от 4,4'-динитрокарбанилид и 2-хидрокси-4,6-диметилпиримидин)

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на никарбазин в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, съдържащи не повече от 5% тревно брашно. Нитрофуранови производни, ацетиленхептин и карбадокс могат да пречат. Долната граница на определянето е 20 ppm.

2. Принцип Пробата се екстрахира с N,N-диметилформамид. Екстрактът се пречиства чрез хроматография на колона с алуминиев окис; никарбазинът се елюира с етанол. Елюатът се обработва с разтвор на натриева основа в етанол, при което се развива жълто оцветяване. Никарбазинът се определя спектрофотометрично при 430 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Пресмятане на резултати Съдържанието на никарбазин в mg на килограм проба се дава от формулата: A/W*F* 10 000 , където: А е количеството никарбазин в mg, както е определено при фотометричното измерване; W – теглото на порцията за изследване в грамове; F – коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1).

7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 10 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание на никарбазин по-малко от 100 ppm; • 10% като относителна стойност – за съдържание между 100 и 5000 ppm; • 500 ppm като абсолютна стойност – за съдържание между 5000 и 10 000 ppm; • 5% като относителна стойност – за съдържание над 10 000 ppm.

XXXVI. Определяне на менадион (витамин K3)

1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на менадион (витамин K3) в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 1 ppm.

2. Принцип Пробата се екстрахира с разреден етанол. Сместа се избистря с разтвор на танин и се центрофугира. Екстрактът се обаботва с разтвор на натриев карбонат; освободеният менадион се екстрахира с 1,2-дихлоретан. В зависимост от съдържанието на менадион дихлоретановият екстракт се обработва или директно, или след изпаряване. Обработването се извършва с 2,4-динитрофенилхидразин в етанол, подкислен със солна киселина. Полученият хидразон, обработен с излишък от амоняк, образува синьозелено оцветен комплекс, чиято оптическа плътност се измерва при 635 nm.

3. Реактиви:

4. Апаратура:

5. Процедура Забележка: Всички операции трябва да бъдат проведени далеч от пряка светлина, с използване на оборудване от тъмно стъкло, където е необходимо.

6. Пресмятане на резултатите Количеството на менадион в пробата се пресмята, като се вземат предвид теглото на пробата и разрежданията, направени в хода на анализа. Резултатите се изразяват в mg менадион на kg.

7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 20%, като относителна стойност – за съдържание на менадион по-малко от 10 ppm; • 2 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 10 и 14 ppm; • 15%, като относителна стойност – за съдържание между 14 и 100 ppm; • 15 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 100 и 150 ppm; • 10%, като относителна стойност – за съдържание по-голямо от 150 ppm.

XXXVII. Определяне на Афлатоксин B1 А. МЕТОД НА ЕДНОДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. Цел и обхват Този метод позволява определяне на количеството Афлатоксин B1 в следните храни за животни: фъстъци, копра, ленено семе, соя, сусам, кюспе от бабасу, палмово и царевично масло, готови тестени храни и зърнени продукти, грахово брашно, картофен пулп и нишесте. Долната граница на определение е 0,01 mg/kg (10 ppb). В присъствието на пречещи субстанции, които затрудняват определението, е необходимо да се започне анализът отново, като се използва метод Б (двудименсионална тънкослойна хроматография).

2. Принцип Пробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът се разтваря повторно в определен обем хлороформ или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се подлага на тънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин B1 се определя с ултравиолетово облъчване на хроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартен Афлатоксин B1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин B1 трябва да бъде потвърдена по посочената процедура.

3. Реактиви: Забележка: Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ А.Р., освен когато е посочено друго.

4. Апаратура:

5. Процедура

6. Изчисляване на резултатите

7. Приготвяне и анализ на стандартен разтвор (3.16)

8. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени с една и съща проба от един и същ аналитик, не трябва да бъде повече от: — 25% по отношение най-високия резултат за съдържания Афлатоксин B_1 от 10 и до 20 \mu\text{g} / \text{kg}; — 5 \mu\text{g}, в абсолютна стойност, за съдържания по-големи от 20 и до 50 \mu\text{g} / \text{kg}; — 10% по отношение най-високата стойност за съдържания над 50 \mu\text{g} / \text{kg}.

9. Възпроизводимост Виж под „Наблюдения“, част С, т. 2. Б.ДВУДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ

1-dup. Цел и обхват Този метод позволява определяне количеството Афлатоксин B_1 в храни за животни, непопадащи в обхвата на метод А. Долната граница на определение е 0,01 mg / kg (10ppb). Методът е неприложим към храни, съдържащи пулп от цитрусови плодове.

2-dup. Принцип Пробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът повторно се разтваря в определен обем хлороформ, или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се подлага на тънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин B1 се определя с ултравиолетово облъчване на хроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартен Афлатоксин B1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин B1 трябва да бъде потвърдена по посочената процедура.

3-dup. Реактиви: Забележка. Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ А.Р., освен когато е посочено друго.

4-dup. Апаратура виж в точка 4 на метод А.

5-dup. Процедура

6-dup. Изчисляване на резултатите виж т. 6 от метод A

7-dup. Повторяемост виж т. 8 от метод A

8-dup. Възпроизводимост виж „Наблюдения“, част B, т. 2 B. Наблюдения по отношение методи A и B

1-dup2. Обезмасляване Проби, съдържащи повече от 5% мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с петролев етер (т.к. 40 до 60 °C) след приготвянето им по 5.1. В такива случаи резултатите от анализа трябва да се изразят чрез теглото на необезмаслената проба.

2-dup2. Възпроизводимост на резултатите Възпроизводимостта на резултатите, т.е. разликите в резултатите, получени от две или повече лаборатории с една и съща проба, се изчислява, както следва: \pm 50\% от средната стойност – за средни стойности Афлатоксин B1 от 10 и до 20 \mu\text{g/kg}; \pm 10\mu\text{g/kg} върху средната стойност – за средни стойности, по-високи от 20 и до 50 \mu\text{g/kg}; \pm 20\% средната стойност – за средни стойности над 50 \mu\text{g/kg}.

XXXVIII. Определяне на авопарцин чрез дифузия в среда на агар

1. Цел и обхват Методът се използва за определянето на авопарцин в храните за животните и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 2 mg/kg (2 части на хиляда). Присъствието на полиетерни антибиотици може да окаже влияние при определянето.

2. Принцип Пробата се извлича със смес от ацетон/вода/солна киселина. Антибиотичната активност на екстракта се определя посредством измерване на дифузията на авопарцина в среда от агар с бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в рамките на спектъра от използваните антибиотични концентрации.

3. Микроорганизъм – бацилус субтилис АТСС 6633 (NCIB 8054)

4. Културни среди и реагенти

5. Стандартни решения Точно претеглено количество от приблизително 10 mg от стандартната субстанция (4.7) се разтваря във фосфатен буфер (4.5) и се разрежда с този буфер, така че да се получи основен разтвор, съдържащ 100 μg авопарцин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4°C, този разтвор остава стабилен в продължение на до 7 дни.

6. Подготвяне на екстракта и разтворите за анализ

7. Процедура на анализиране на пробата

8. Оценка Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху хартия за полулогаритмична графика (милиметрова), която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на „най-добро напасване“ както на стандартния разтвор, така и на екстракта. Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - 2S_8}{10} \quad (1) Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-високо ниво (SH) се определя по формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - 2S_1}{10} \quad (2) Аналогично се изчисляват точките на „най-добро напасване“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят U_1, U_2, U_4 и U_8 с S_1, S_2, S_4 и S_8 в посочените формули. Изчислените стойности на SL и SH се заместват върху млиметрова хартия и се свързват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UH и се свързват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за екстракта. В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите трябва да са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни при положение, че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности. Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U_1 и U_4 или U_8 и S_8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на „най-добро напасване“: SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на „най-добро напасване“ се проверяват за успоредност, така както е показано тук, погоре. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива. Ако се приеме, че линиите са успоредни, тогава се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм A) посредством една от следните формули: \text{За четири нива -} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) \text{За три нива -} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) \text{или} Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност. Ако бъде установено, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, то всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да се отбележи в крайния отчет. Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.

9. Повторяемост Разликата между резултатите на двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и отедин и същ аналитик, не трябва да надвишава: – 2 mg/kg в абсолютна стойност за съдържания на авопарцин от 2 и нагоре до 10 mg/kg; – 20 % спрямо най-високата стойност – за съдържания от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържания от 25 до 50 mg/kg; – 10 % спрямо най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg.

XXXIX. Определяне на монензин натрии посредством дифузия в среда на агар

1. Цел и обхват Методът се използва за определянето на монензин натрии в храните за животните и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 10 mg/kg (10 части на хиляда).

2. Принцип Пробата се извлича посредством 90 % метанол. Екстрактът се подлага на съответни процедури, в съответствие със съдържанието на монензин натрии в пробата. Антибиотичната активност се определя, като се измери дифузията на монензин натрии в среда от агар, върху която има посявка на бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в целия спектър на използваните антибиотични концентрации. Чувствителността на тази система на пробата за анализи се намалява в присъствието на натриеви йони.

3. Микроорганизъм – бацилус субтилис АТСС 6633 (NCIB 8054)

4. Културни среди и реагенти

5. Апаратура

6. Стандартни решения Разтваря се точно претеглено количество от стандартната субстанция (4.8) в метанол (4.4), така че да се получи основен разтвор, съдържащ 800 µg натриев монензин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4 °C, този разтвор остава стабилен в продължение на до две седмици. От този фондов разтвор се подготвят посредством последователно разреждане с 50 % метанол (4.6) следните разтвори: S_8 8 mg/l S_4 4 mg/l S_2 2 mg/l S_1 1 mg/l

7. Подготвяне на екстракта

8. Процедура за анализиране на пробата

9. Оценка Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на „най-добро напасване“ както на стандартния разтвор, така и на екстракта, както е показано например тук по-долу. Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - 2S_8}{10} \quad (1) Определя се пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - 2S_1}{10} \quad (2) Аналогично се изчисляват точките на „най-добро напасване“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместват U_1, U_2, U_4 и U_8 с S_1, S_2, S_4 и S_8 в посочените формули. Изчислените стойности на SL и SH се записват върху същата хартия за чертане на диаграми (милиметрова) и се обединяват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UH и се обединяват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за екстракта. В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни, при положение че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности. Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U_1 и S_1, или U_8 и S_8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на „най-добро напасване“: SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на „най-добро напасване“ се проверят за успоредност, както е показано по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива. Ако се приеме, че линиите са успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм A) посредством една от следните формули: За четири нива – Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) За три нива – Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) или Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност. Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата от 0,75 до 2,70, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта, а ако това не е възможно – към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет. Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.

10. Повторяемост Разликата между резултатите от двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и от един и същ аналитик, не трябва да надвишава: – 20 % спрямо най-високата стойност – за съдържания на монензин натрии от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържания от 25 до 50 mg/kg; – 10 % спрямо най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg. XL. Определяне на халофугинон DL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-квиназолин-4-(3H)-на хидробромид

1-dup. Цел и обхват Методът се използва за определянето на халофугинон в храните за животните. Долната граница за определянето е 1 mg/kg.

2-dup. Принцип След третиране с гореща вода халофугинонът се екстрахира като свободна основа в етилов ацетат и след това се разделя като хидрохлорид във воден киселинен разтвор. Екстрактът се очиства посредством хроматография с йонен обмен. Съдържанието на халофугинона се определя посредством високочестотна хроматография със запазена фаза (HPLC), като се използва детектор на ултравиолетови лъчи.

3-dup. Реагенти:

4-dup. Апаратура:

5-dup. Процедура Забележка. Халофугинонът като свободна основа е нестабилен в разтвори на алкалин и на етилов ацетат, ако не остане в етиловия ацетат в продължение на повече от 30 min.

6-dup. Изчисляване на резултатите Концентрацията на разтвора на пробата в mg/ml се определя от средната височина (участък) на пиковете за халофугинона, като се използват препратки към графиката на калибрирането (5.4.2). Съдържанието на халофугинона в тегловни проценти w (mg/kg) в пробата се дава със следната формула: c.10m w = \frac{}{m}, където: с е концентрацията на халофугинона в разтвора на пробата в mg/ml; m - масата на изпробваната част в грамове.

7-dup. Валидизиране на резултатите

8-dup. Резултати от съвместно изпитване Резултатите от съвместно изпитване, при което три проби са подложени на анализ от осем лаборатории, са представени в таблицата. Резултати Празна А при получаване Проба В (брашно) при получаване Проба В (брашно) след два месеца Проба С (гранули) при получаване Проба С (гранули) след два месеца Средна (1) n.d. 2.80 2.42 2.89 2.45 SR - 0,45 0,43 0,40 0,42 CVR - 16 18 14 17 Възстановяване - 86 74 88 75 (1) – единици в mg/kg n.d. - не е открито SR - стандартно отклонение на повторяемост CVR - коефицент на вариация на повторяемостта Възстановяване (%) XLI. Метод за определяне на робенидин

1-dup2. Определяне на robenidine 1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine-hydrochloride

1-dup3. Цели и обсег Този метод се използва за определяне съдържанието на robenidine във фуражите, като долната граница на определяне е 5 mg/kg.

2-dup2. Принцип Пробата се екстрахира с помощта на кисел метанол. Екстрактът се изсушава, след което аликвотна част от него се подлага на изчистване в колона с алуминиев окис. Robenidine се елуира от колоната с метанол. След като се концентрира, към него се добавя ново количество, за да се постигне подходящият за мобилната фаза обем. Съдържанието на robenidine се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с много високи работни характеристики на базата на утравиолетов детектор.

3-dup2. Реактиви

4-dup2. Апаратура

5-dup2. Процедура Забележка. Робенидинът е чувствителен към светлина. Да се използват тъмнокехлибарени стъкленици във всички операции.

6-dup2. Изчисление на резултатите От средната височина (област) на робенидиновите пикове се определя концентрацията на мострения разтвор в \mu\text{g}/\text{ml} на базата на калибрационната графика (5.4.2). Съдържанието на робенидин w (\text{mg}/\text{kg}) в пробата е дадена в следната формула: 200c W = \frac{\text{mg}}{\text{ml}} [\text{mg}/\text{kg}] където: с е концентрацията на робенидин в мострения разтвор в \mu\text{g}/\text{ml}; m – масата на тестовата позиция в g.

7-dup2. Потвърждаване на резултатите

8-dup2. Резултати от съвместно изследване При организирано съвместно изследване, проведено от 12 лаборатории, при което предмет на анализ са четири фуражни проби от храната на домашни птици и зайци във формата на шрот или гранули, като всяка проба се подлага на двоен анализ, се получават следните резултати, представени в таблицата: Домашни птици Зайци шрот гранули шрот гранули Средна (mg/kg) 27,00 27,99 43,6 40,1 S_1 (mg/kg) 1,46 1,26 1,44 1,66 CV_1 (%) 5,4 4,5 3,3 4,1 S_1 (mg/kg) 4,36 3,36 4,61 3,91 CV_R (%) 16,1 12,0 10,6 9,7 Възстановяване (%) 90,0 93,3 87,2 80,2 S_1 – стандартно отклонение на повторяемост CV_1 – коефицент на вариация на повторяемостта S_R – стандартно отклонение на възпроизводимост CV_R – коефицент на вариация на възпроизводимостта XLII. Определяне на methyl benzoquate 7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone

1-dup4. Цели и обхват Този метод се използва за определяне съдържанието на methyl benzoquate във фуражите, като долната граница на определяне е 1 mg/kg.

2-dup3. Принцип Метиловият benzoquate се екстрахира от пробата с помощта на метанолова метаносулфонова киселина. Екстрактът се пречиства с дихлорметан чрез йоннообменна хроматография и после отново с дихлорметан. Съдържанието на метиловия benzoquate се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с много високи работни характеристики на базата на ултравиолетов детектор.

3-dup3. Реактиви

4-dup3. Апаратура

5-dup3. Процедура

6-dup3. Изчисление на резултатите От средната височина (област) на пиковете на methyl benzoquate се определя концентрацията на мострения разтвор в μg/ml, като се използва калибрационната графика (5.6.2). Съдържанието на methyl benzoquate w (mg/kg) в пробата е дадена в следната формула: 200c W = \frac{}{m} където: c е концентрацията на methyl benzoquate в мострения разтвор в μg/ml; m - масата на тестовата позиция в g.

7-dup3. Потвърждаване на резултатите

8-dup3. Резултати от съвместно изследване Пет проби се подлагат на анализ от 10 лаборатории. За всяка една проба са проведени двойни анализи. Резултатите са представени в таблицата: Празна проба Шрот 1 Гранули 1 Шрот 2 Гранули 2 Средна (mg/kg) n.d. 4,50 4,50 8,90 8,70 S_1 (mg/kg) n.d. 0,30 0,20 0,60 0,50 CV_1 (%) n.d. 6,70 4,40 6,70 5,70 S_1 (mg/kg) n.d. 0,40 0,50 0,90 5,70 CV_R (%) n.d. 8,90 11,00 10,10 11,00 Възстановяване (%) n.d. 92,00 93,00 92,00 89,00 n.d. - не е открито S_1 - стандартно отклонение на повторяемост CV_1 - коефицент на вариация на повторяемостта S_R - стандартно отклонение на възпроизводимост CV_R - коефицент на вариация на възпроизводимостта XLIII. Определяне на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар

1-dup5. Цел и обхват Методът е за определяне на спирамицин в животински храни и предварително приготвени смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ppm)(1).

2-dup4. Принцип Пробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при pH 8. Извлекът се декантира или центрофугира и разрежда. Нейната антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията на спирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зони на инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации.

3-dup4. Микроорганизъм - Microccus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

4-dup4. Културална среда и реактиви

5-dup4. Стандартни разтвори Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °C, този разтвор е стабилен до 5 дни. От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори: S_8 - 1 \text{ IU/ml} S_4 - 0,5 \text{ IU/ml} S_2 - 0,25 \text{ IU/ml}

6-dup4. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ

7-dup4. Процедура на извършване на анализа

8-dup4. Оценяване Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма на концентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствие на стандартния разтвор и екстракта. Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използва формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - S_8}{10} \quad (1) Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - S_1}{10} \quad (2) По подобен начин се изчисляват и „най-точно съответстващите“ точки за най-ниските нива на екстракта (UL) и най-високите нива на екстракта (UH) като във формулите се заменят S_1, S_2 и S_8 с U_1, U_4 и U_8. Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за екстракта. При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат да се считат паралелни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10% от тяхната средна аритметична стойност. Ако се окаже, че линиите не са паралелни u_1 и s_1 или u_8 и s_8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да се изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на „най-точно съответствие“ SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет. Малките букви „s“ и „u“ се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране. Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (\log A) посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка на успоредността. \text{За четири нива –} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) \text{За три нива –} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) \text{или} Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по A: (U_8 = S_8 \times A) Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно – на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет. Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтаря. Ако пак не може да се получи успоредност, определянето се счита за незадоволително. Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg животинска храна.

9-dup. Повторяемост Разликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия лаборант, не трябва да превишава: – 2 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg; – 20% от най-високата стойност – за съдържания от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържание от 25 до 50 mg/kg; – 10% от най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg. XLIV. Определяне на диклазурил (+) – 4-хлорфенил [2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил] ацетонитрил

1-dup6. Цели и обхват Това е метод за определяне на диклазурил в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване е 0,1 mg/kg. Границата на определяне е 0,5 mg/kg

2-dup5. Принцип След добавяне на вътрешен еталон пробата се извлича с подкиселен метанол. При животински храни аликватната част на екстракта се пречиства в екстракционен патрон C18 твърда фаза. Диклазурилът се отмива от патрона със смес от подкиселен метанол и вода. След изпаряване остатъкът се разтваря в DMF/вода. При предварително приготвени смеси екстрактът се изпарява и остатъкът се разтваря в DMF/вода. Съдържанието на диклазурил се определя чрез течна хроматография троичен градиент обратна фаза (HPLC) с използване на УВ детектор.

3-dup5. Реагенти

4-dup5. Апарати

5-dup5. Процедура

6-dup5. Изчисляване на резултатите

7-dup5. Установяване на достоверността на резултатите

8-dup5. Резултати от съвместното изследване При анализа на пет мостри (тези проби включват 2 предварително приготвени смеси – едната, смесена с органична матрица (O 100), а другата – с неорганична матрица (A 100). Теоретичното съдържание е 100 mg диклазурил на kg. Двете смесени храни за птици са произведени от 3 различни производители (NL) (L1/Z1/K1). Теоретичното съдържание е 1 mg диклазурил на kg. Лабораториите са инструктирани да анализират всяка проба един или два пъти.) от 11 лаборатории се получават следните резултати, дадени в долната таблица: Пример 1 A 100 Пример 2 O 100 Пример 3 L 100 Пример 4 Z 1 Пример 5 K 1 L 11 11 11 11 6 n 19 18 19 19 12 mean 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89 S_r (mg/kg) 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 CV_r (%) 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34 S_R (mg/kg) 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 CV_R (%) 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65 Номинално съдържание 100 100 1 1 1 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; S_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост.

9-dup2. Забележка. Трябва предварително да бъде показано, че реакцията на диклазурил в обхвата на концентрациите е линейна. XLV. Определяне на карбадокс Метил 3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1,N4-диоксид

1-dup7. Цели и обхват Това е метод за определяне на карбадокс в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване е 1 mg/kg; границата на определяне е 10 mg/kg.

2-dup6. Принцип Пробата се уравновесява с вода и се извлича с метанол-ацетонитрил. При животинските храни аликватна част на филтрирания екстракт се подлага на почистване в алуминиева оксидна колона. При предварително приготвените смеси и препарати аликватна част от филтрирания екстракт се разрежда до подходяща концентрация с вода, метанол и ацетонитрил. Съдържанието на карбадокс се определя с помощта на висококачествена течна хроматография обратна фаза, като се използва УВ детектор.

3-dup6. Реагенти

4-dup6. Апарати

5-dup6. Процедура Забележка. Карбадоксът е чувствителен на светлина. Всички процедури се извършват при намалена светлина или се използват тъмни стъкленици или стъкленици, увити в алуминиево фолио.

6-dup6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площи) на пиковете на карбадокс на разтвора на пробата се определя концентрацията на разтвора на пробата в \mu\text{g}/\text{ml} чрез сравняване с калибриращата графика (5.4.2).

7-dup6. Установяване на достоверността на резултатите

8-dup6. Резултати от съвместното изследване При анализиране на шест животински храни, четири предварително приготвени смеси и три препарата (на всяка проба бяха извършени дублирани анализи) от 8 лаборатории се получават резултатите (с изключение на различаващите се от нормалните стойности), дадени в следната таблица: Таблица 1. Резултати от съвместното изследване на животински храни Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5 Проба 6 L 8 8 8 8 8 8 N 15 14 15 15 15 15 Средна (mg/kg) 50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7 Sr (mg/kg) 2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12 CVr (%) 5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3 SR (mg/kg) 3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44 CVR (%) 7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9 Номинално 50,0 съдържание (mg/kg) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 Таблица 2. Резултати от съвместното изследване на предварително приготвени смеси и препарати Предварително приготвени смеси Препарати A B C D A B C L 7 7 7 7 8 8 8 N 14 14 14 14 16 16 16 Средна (g/kg) 8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104 Sr (g/kg) 0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7 CVr (%) 4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4 SR (g/kg) 0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7 CVR (%) 4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4 Номинално съдържание (g/kg) 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; Sr – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVr – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVI. Определяне на витамин A

1-dup8. Цел и обхват Това е метод за определяне на витамин A (ретинол) в животински храни и предварително приготвени смеси. Витамин A включва всички транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери, които се определят по този метод. Съдържанието на витамин A се изразява в международни единици (IU) на kg. Една IU отговаря на активността на 0,300 µg от всички транс-витамин A алкохоли или на 0,344 µg от всички транс-витамин A ацетати или 0,550 µg от всички транс-витамин A палмитати. Границата на определяне е 2000 IU витамин A/kg.

2-dup7. Принцип Пробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин A се извлича в петролен етер. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин A се определя чрез висококачествена течна хроматография обратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор. Хроматографските параметри се избират, така че да няма разделяне между всичките транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери.

3-dup7. Реагенти

4-dup7. Апаратура

5-dup7. Процедура Забележка. Витамин A е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиево фолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва се излишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време).

6-dup7. Изчисляване на резултатите От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин A на разтвора на пробата с помощта на калибриращата графика (5.6.2) се определя концентрацията на разтвора на пробата в IU/ml. Съдържанието на витамин A w в IU/kg на пробата се дава със следната формула: 500.\beta.V_2.1000 w = \frac{V_1 \text{ m}}{V_1 \text{ m}}, където: \beta е концентрацията на разтвора на пробата (5.4) в IU/ml; V_1 – обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml; V_2 – обемът на аликвота, взет в (5.4) в ml; m – масата на тествана част в g.

7-dup7. Забележки

8-dup7. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да превишават 15% спрямо най-високия резултат.

9-dup3. Резултати от съвместно междулабораторно изследване Премикс Премикс фураж Минерален концентрат Протеин фураж Piglet L 13 12 13 12 13 n 48 45 47 46 49 Mean [IU/kg] 17.02x106 1.21 x106 537 100 151 800 18 070 Sn[IU/kg] 0.51 x106 0.039 x106 22 080 12 280 682 r[IU/kg] 1.43 x106 0.109 x106 61 824 34 384 1910 CVr[%] 3.0 3.5 4.1 8.1 3.8 SR 1.36 x106 0.069 x106 46 300 23 060 3614 R 3.81 x106 0.193 x106 129 640 64 568 10 119 CVR[%] 8.0 6.2 8.6 15 20 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; S_f – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_f – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVII. Определяне на витамин E

1-dup9. Цел и обхват Това е метод за определяне на витамин E в животински храни и предварително приготвени смеси. Съдържанието на витамин E се изразява като mg DL-\alpha-токоферол ацетат на kg. Един милиграм DL-\alpha-токоферол ацетат отговаря на 0,91 mg DL-\alpha-токоферол (витамин E). Границата на определяне е 2 mg витамин E/kg.

2-dup8. Принцип Пробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин E се извлича в петролев етер. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин E се определя чрез висококачествена течна хроматография обратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор.

3-dup8. Реагенти

4-dup8. Апаратура

5-dup8. Процедура Забележка. Витамин E е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиево фолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва се излишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време).

6-dup8. Изчисляване на резултатите От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин E на разтвора на пробата се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml (изчислена като \alpha-токоферол ацетат) с помощта на калибриращата графика (5.6.1.2 или 5.6.2.2). Съдържанието на витамин E w в mg/kg на пробата се определя със следната формула: W = \frac{500.\beta \cdot V_2}{V_1 \cdot m} [\text{mg/kg}] където: \beta е концентрацията на витамин E в разтвора на пробата (5.4) в IU /ml; V_1 – обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml; V_2 – обемът на аликвота, взет в 5.4 в ml; m – масата на тествана част в g.

7-dup8. Забележки

8-dup8. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща проба, не трябва да превишават 15 % спрямо най-високия резултат.

9-dup4. Резултати от съвместно междулабораторно изследване: Премикс Премикс фураж Минерален концентрат Протеин фураж Piglet L 12 12 13 12 13 n 48 48 48 48 48 Mean [mg/kg] 17380 1187 926 315 61,3 S_{\text{[mg/kg]}} 384 45,3 25,2 13,0 2,3 r[\text{mg/kg}] 1075 126,8 70,6 36,4 6,4 CV_{\text{[%]}}: 2,2 3,8 2,7 4,1 3,8 S_{\text{[mg/kg]}} 830 65,0 55,5 18,9 7,8 R[\text{mg/kg}] 2324 182,0 155,4 52,9 21,8 CV_{\text{[%]}}: 4=8 5,5 6,0 6,0 6,0 12,7 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_{\text{R}} – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_{\text{R}} – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_{\text{r}} – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVIII. Определяне на триптофан

1-dup10. Цел и обхват Това е метод за определяне на общото съдържание и свободния триптофан в животински храни. Той не различава D и L формите.

2-dup9. Принцип За да се определи общото съдържание на триптофан, пробата се хидролизира в алкална среда с наситен разтвор на бариев хидроксид и се нагрява до 110 °C в продължение на 20 h. След хидролизата се добавя вътрешен еталон. За да се определи свободният триптофан, пробата се извлича в слабо кисела среда в присъствието на вътрешен еталон. Триптофанът и вътрешният еталон в хидролизата или екстракта се определят с помощта на HPLC с флуоресцентна детекция.

3-dup9. Реагенти:

4-dup9. Апарати:

5-dup9. Процедура

6-dup9. Изчисляване на резултати A.B.C.D.E.MW —= g триптофан pd 100 g проба, F.G.H.10 000.W където: A е площта на пика на вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор (3.17); B – площта на пика на триптофан, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3); C – обемът в ml (2 ml) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до калибриращия разтвор (3.17); D – концентрация в \mu\text{mol/ml} (=2,50) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до калибриращия разтвор (3.17); E – обем в ml на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен при екстракцията (5.2) (= 5,00 ml) или към хидролизата (5.3) (=2); F – площта на пика на вътрешния еталон, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3); G – площта на пика на триптофан, калибриращ стандартен разтвор (3.17); H – обемът в ml (=2 ml) на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен към калибриращия еталонен разтвор (3.17); W – теглото на пробата в g (коригирано или оригинално тегло, ако е изсушавана или са отнемани мазнини); MW – молекулното тегло на триптофан (=204,23).

7-dup9. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да превишават 10 % спрямо най-високия резултат.

8-dup9. Резултати от съвместното изследване При организиране на съвместно изследване, в което три проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа) се анализират в 12 лаборатории, за да се сертифицира методът за хидролиза, се получават следните резултати, дадени в таблицата: Проба 1 Фураж за свине Проба 2 Фураж за свине с L-триптофан Проба 3 L 12 12 12 n 50 55 50 Mean [g/kg] 2,42 3,40 4,22 S_r[\text{g/kg}] 0,05 0,05 0,08 r[\text{g/kg}] 0,14 0,14 0,22 CV_r[\%]: 1,9 1,6 1,9 S_R[\text{g/kg}] 0,15 0,20 0,09 R[\text{g/kg}] 0,42 0,56 0,25 CV_R[\%]: 6,3 6,0 2,2 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост. При друго съвместно изследване, в което две проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа) се анализират в 13 лаборатории, за да се сертифицира методът за извличане на свободния триптофан, се получават резултатите, дадени в таблицата: Проба 4 Смес от пшеница и соя Проба 5 Смес от пшеница и соя = проба 4 с триптофан (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Mean [g/kg] 0,391 0,931 S_r[\text{g/kg}] 0,005 0,012 r[\text{g/kg}] 0,014 0,034 CV_r[\%]: 1,34 1,34 S_R[\text{g/kg}] 0,018 0,048 R[\text{g/kg}] 0,050 0,134 CV_R[\%]: 4,71 5,11 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост. При изследване, в което четири проби (на всяка проба бяха извършени по 5 анализа) бяха анализирани в 7 лаборатории, с цел да се сертифицира триптофан за хидролиза се получават резултатите, дадени в таблицата: Проба 1 Фураж за свине (CRM 117) Проба 2 Рибно брашно с ниско съдържание на мазнини (CRM 118) Проба 3 Соево брашно (CRM 119) Проба 4 Обезмаслено мляко на прах (CRM 120) L 7 7 7 7 N 25 25 25 25 Mean [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr[g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r[g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr[%]: 1,04 1,15 1,30 0,76 SR[g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R[g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR[%]: 1,48 4,69 4,11 4,22 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; sr – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVr – коефициент на вариации на възпроизводимост.

9-dup5. Наблюдения