Наредба № 44 от 7 октомври 2002 г. за вземане на проби и методи за анализ при контрол на фуражите

Чл. 1

С тази наредба се уреждат редът за вземане на проби и методите за анализ при контрол на фуражите.

Чл. 2

Вземането на проби се извършва от инспектори на Главната дирекция за контрол на фуражите (ГДКФ) в Националната служба по зърното и/или от инспектори на Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС).

Чл. 3

(1) За вземане на проби се използват уреди, изработени от материали, невлияещи на фуражите, от които се взема пробата.

(2) За вземане на единични проби се използват уредите, посочени в приложение №1.

Чл. 4

От партидите фуражи се вземат следните видове проби:

1. единична проба (извадка);

2. сборна проба (изходна);

3. редуцирана сборна проба (средна проба);

4. крайна проба (лабораторна).

Чл. 5

(1) За контрол на фуражите се използват партиди с размери, които дават възможност за вземане на достатъчно проби, представителни за всички части на партидата.

(2) В зависимост от вида на фуража и размера на партидата се вземат минимален брой единични проби съгласно приложение № 2.

(3) Когато не могат да бъдат взети единични проби от всички части на партидата поради нейния размер или местоположение, за размер на партидата се приема само частта, от която са взети единичните проби.

Чл. 6

(1) Пробите се вземат и образуват по възможно най-бърз начин, който изключва тяхното замърсяване и изменение в сравнение с останалата част на партидата.

(2) За вземане и образуване на проби се използват почистени и подсушени инструменти, работни повърхности и съдове.

(3) Инспекторите вземат нужните предпазни мерки за предотвратяване изменението на състава, замърсяването и повреждането на пробата по време на транспорт и съхранение.

Чл. 7

(1) Единичните проби при контрол на вещества или субстанции, разпределени равномерно във фуражите, се вземат произволно от цялата партида. Те трябва да са с еднакво тегло или обем.

(2) При вземане на единични проби от насипни фуражи, които са в съдове над 100 kg, партидата мислено се разделя на равни части и се взема необходимият брой проби съгласно приложение № 2.

(3) При вземане на единични проби от опаковани фуражи от всяка опаковка се взема част от съдържанието.

(4) При вземане на единични проби от течни или полутечни смесими фуражи от всяка опаковка или съд се взема най-малко една проба. Единичната проба се взема след хомогенизиране съдържанието на фуража.

(5) При вземане на единични проби от течни и полутечни фуражи, които не могат да се смесват, се вземат проби от различни височини на съдовете съгласно приложение № 2. В тези случаи обемът на сборните проби е минимум 10 l.

(6) При вземане на единични проби от фуражи на блокчета или „буци за лизане“ от всеки фуражен блок или „буца за лизане“ се взима по една част.

Чл. 8

(1) От единичните проби, взети от една партида, се образува само една сборна проба, с изключение на сборната проба за анализ на нежелани или забранени вещества, която се образува съгласно приложение № 3.

(2) Сборните проби се образуват от единичните проби съгласно приложение № 4. При образуване на сборна проба единичните проби се размесват добре.

Чл. 9

(1) При образуване на сборни проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно, партидата се разделя мислено на толкова части, колкото са сборните проби, посочени в приложение № 3. Общият брой единични проби, взети от партидата, се разпределя приблизително равномерно в тези части, като във всяка сборна проба се включват единични проби, взети от различни части на партидата.

(2) Сборните проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно в партидата, са не по-малки от 4 kg или 4 l.

Чл. 10

(1) Сборните проби се образуват чрез смесване до получаване на еднородна смес. Буците се начупват отделно от останалия материал, след което се смесват с него.

(2) За образуване на крайна проба може да се образува редуцирана сборна проба, като сборната проба се намали до 2 kg или 2 l чрез механичен разделител или чрез разчетворяване.

Чл. 11

(1) От всяка сборна проба или редуцирана сборна проба се образуват най-малко три крайни проби.

(2) Според вида на партидата минималното количество на крайната проба се определя съгласно приложение № 5.

Чл. 12

(1) Крайните проби се съхраняват в чисти и сухи опаковки или съдове, които не пропускат влага и се затварят добре. При възможност се използват съдове, които се затварят херметически.

(2) Съдовете по ал. 1 се пломбират или запечатват така, че при отваряне на съда да се наруши целостта на пломбата или печата.

Чл. 13

(1) При вземане на проби се съставя протокол за вземане на проби в три екземпляра, в който се посочват видът и номерът на партидата, от която са взети.

(2) Всяка крайна проба се придружава от екземпляр от протокола по ал. 1.

Чл. 14

(1) Крайните проби се означават с етикети, които съдържат:

1. име и адрес на инспектора;

2. дата на образуване на крайната проба;

3. номер и дата на протокола за вземане на проби;

4. описание на фуража;

5. номер на пломбата или печата.

(2) В етикета могат да се включат и други данни за пробата.

Чл. 15

Инспекторите изпращат една крайна проба на лабораторията, която ще извърши анализите, втората крайна проба се предава за съхранение на собственика на партидата, а третата се съхранява от контролния орган за евентуален арбитражен анализ.

Чл. 16

При контрол на качеството и на съдържанието на вещества във фуражите пробите се анализират по методите, посочени в приложение № 6.

Чл. 17

(1) Методите за анализ по приложение № 6 се прилагат за всички видове фуражи.

(2) Когато някой от методите има специално приложение при анализа на определени видове фуражи, то е посочено в точка „Наблюдения“ на съответния метод.

Чл. 18

(1) За анализ на всяко вещество във фуражите се използва един от методите по приложение № 6.

(2) Когато за анализ на едно вещество могат да се използват два или повече метода, включени в приложение № 6, изборът на метод се извършва от лабораторията, която прави анализа. Избраният метод се означава в анализното свидетелство.

Чл. 19

При описание на методите за анализ в приложение № 6 са посочени само уредите и апаратите, които са специални или са по специален стандарт, без да се посочва оборудването, което е обичайно за лаборатории за анализ.

Чл. 20

(1) Лабораторията отразява резултатите от проведените анализи в анализно свидетелство.

(2) Резултатите от анализа представляват средна стойност от поне две изследвания. Резултатите от анализа са с такава точност, каквато методът за анализ позволява.

§ 1

По смисъла на тази наредба:

1. „Партида“ е определено количество фураж, представляващо еднородна маса, което е продукт на непрекъснат производствен процес и се предлага на пазара като цяло.

2. „Единична проба“ (извадка) е определена част от партидата фуражи, която се взема еднократно от определено място на партидата и служи за съставяне на сборна (изходна) проба.

3. „Сборна проба“ (изходна) е общото количество от всички единични проби (извадки), взети от една партида.

4. „Редуцирана сборна проба“ е представителната част от формираната сборна (изходна) проба.

5. „Крайна проба“ (лабораторна) е определено количество от формираната сборна (изходна) или редуцираната сборна проба.

§ 2

Наредбата се издава на основание чл.11, ал.3 от Закона за фуражите (обн., ДВ, бр. 82 от 1999 г.; изм., бр. 101 от 2000 г.).

§ 3

Изпълнението на наредбата се възлага на ръководителите на Националната служба по зърното и Националната ветеринарномедицинска служба. Министър: М. Дикме

Приложение 1 Приложение № 1 към чл.3, ал.2

Уреди за вземане на единична проба А. Ръчни уреди: 1. сонди за вземане на проби с дълъг прорез или камери, съответстващи на размера на партидата и на размера на частиците на веществата; 2. лопатки с равна основа и огънат под прав ъгъл нагоре кант. Б. Механичен уред за вземане на проби от веществата по време на производствения процес – автоматичен пробовземач. В. Уреди за вземане на единични проби от течни или полутечни вещества: 1. пипета; 2. уред за черпене с устройство за затваряне. Г. Делителни устройства за създаване на редуцирани, сборни и крайни проби: 1. делителен конус; 2. делител многоулеен.

Приложение 2 Приложение № 2 към чл.5, ал.2

Минимален брой единични проби, взимани от партидите Вид и количество на партидата Минимален брой единични проби (извадки) 1. Твърди вещества неопаковани (насипни) и вещества в съдове над 100 kg: Силаж от зелен фураж, листа от цвекло, сено и слама 20 Ливадни растения 50 Други вещества До 2,5 t 7 Над 2,5 t Корен квадратен от 20-кратното тегло на партидата, изразено в тонове, максимум 40 2. Опаковани вещества 2.1. Опаковки със съдържание до 1 kg 4 2.2. Опаковки със съдържание над 1 kg: 2.2.1. Партиди от 1 до 4 опаковки От всяка опаковка 2.2.2. Партиди от 5 до 16 опаковки 4 2.2.3. Партиди над 16 опаковки Корен квадратен от броя на опаковките, закръглен до цели числа, максимум 20 3. Течни или полутечни вещества: Съдове 3.1. В съдове с вместимост над 1 l 3.1.1. Партиди до 4 съда От всички съдове 3.1.2. Партиди от 5 до 16 съда 4 3.1.3. Партиди над 16 съда Корен квадратен от броя на съдовете, съставляващи партидата, максимум 20 3.2. Съдове с вместимост до 1 l 4 4. Фуражни блокчета и буци за близане По 1 от партида от 25 единици – максимум 4

Приложение 3 Приложение № 3 към чл. 8, ал. 1

Минимален брой сборни проби за анализ на нежелани или забранени вещества Вид и размер на партидата, тон/опаковки Минимален брой сборни (изходни) проби, взети от една партида Насипни, неопаковани: До 1 t 1 Над 1 t до 10 t 2 Над 10 t до 40 t 3 Над 40 t 4 Опаковани: До 16 опаковки 1 От 17 до 200 опаковки 2 От 201 до 800 опаковки 3 Над 800 опаковки 4

Приложение 4 Приложение № 4 към чл.8, ал. 2

Минимално тегло на сборните проби Вид и количество на партидата Минимално тегло на сборната (изходната) проба 1. Насипни, неопаковани и фуражи в съдове: – Сено, слама 1kg – Други фуражи 4kg 2. Опаковани фуражи 2.1. В опаковки със съдържание до 1 kg Съдържанието на 4 опаковки 2.2. В опаковки със съдържание над 1 kg 4 kg 3. Течни или полутечни фуражи: 3.1. В съдове с вместимост до 1 l Съдържание на 4 съда 3.2. В съдове с вместимост над 1 l 4 l 4. Фуражни блокчета и буци за близане 4.1. С единично тегло до 1 kg 4 броя 4.2. С единично тегло над 1 kg 4 kg 5. Добавки 200 g или 200 ml 6. Премикси 1 kg или 1 l

Приложение 5 Приложение № 5 към чл. 11, ал. 2

Минимално тегло на крайните проби Вид партида Минимално тегло на крайна (лабораторна) проба 1. Твърди фуражи: Сено, слама 250 g Ливадни растения, зелени фуражи, зелен силаж и други сочни фуражи 1 kg Други фуражи 0,5 kg 2. Течни или полутечни фуражи 0,5 l 3. Добавки 50 g 4. Премикси 250 g

Приложение 6 Приложение № 6 към чл. 16

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ ОБЩИ ИЗИСКВАНИЯ А. Подготовка за анализ Процедурите по подготовка на пробите за анализ се отнасят до крайните проби, които са изпратени на контролните лаборатории, след като са взети в съответствие с изискванията на Наредбата за методите за вземане на проби при официалния контрол на фуражите. Пробите трябва да са взети по такъв начин, че отделените за анализ количества, както е регламентирано в аналитичните методи, да са хомогенни и представителни за крайните проби. Всички необходими процедури при взимането на пробата се извършват така, че в максимална степен да се избегне замърсяването на пробата и промените в нейния състав. Смилането, разбъркването и пресяването се извършват възможно най-бързо, при минималното излагане на пробата на въздух и светлина. Не трябва да се използват смилащи устройства, които могат значително да нагреят пробата. Препоръчително е фуражите, които са особено чувствителни към топлина, да се смилат ръчно. Необходимо е да се вземат предпазни мерки използваната апаратура да не представлява източник на остатъчно замърсяване. Съдържанието на влага се измерва преди и след изготвянето на пробата, ако при подготовката на пробата се промени съдържанието на влага. Окончателната проба се разбърква добре механично или на ръка и се разделя на две еднакви части (ако е възможно, се използва методът на четвъртинките). Запазва се едната от частите в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка, а другата част или представителна част от нея, не по-малко от 100 g, се подготвя по следния начин: 1. Храни, които непосредствено подлежат на смилане Ако не е предвидено друго в методите за анализ, цялата проба се пресява през сито с квадратни отвори с размер 1 mm2 (в съответствие с препоръчките на ISO R565) след смилането ѝ, ако това е необходимо. Желателно е да се избягва прекалено ситното смилане. Пресятата проба се разбърква и се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се отново, преди да се отдели предназначеното за анализ количество. 2. Храни, които подлежат на смилане след изсушаване Ако не е предвидено друго в методите за анализ, пробата се изсушава, докато съдържанието на влага е от порядъка 8 – 12% в съответствие с предварителната процедура за изсушаване, описана в начина за установяване на водното съдържание, след което се прилага т. 1. 3. Течни или полутечни храни Пробата се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се добре непосредствено преди отделяне на предназначеното за анализ количество. 4. Други храни Пробите, които не могат да се приготвят чрез една от описаните процедури, се обработват чрез всяка друга процедура, която гарантира, че отделените за анализиране количества са хомогенни и представителни за окончателната проба. 5. Съхраняване на пробите Пробите се съхраняват при температура, която не променя техния състав. Пробите, предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни към светлината, се съхраняват в съдове от кафяво стъкло. Б. Реактиви и апаратура, използвани при методите за анализ 1. Ако не е предвидено друго в методите за анализ, всички аналитични реактиви трябва да бъдат аналитично чисти (ан.ч.). При изследване за остатъчни елементи чистотата на реактивите се установява посредством специален тест. В зависимост от получените резултати може да се изисква допълнително пречистване на реактивите. 2. При всяка посочена в аналитичните методи процедура, включваща подготовката на разтвори, разреждане, изплакване или измиване, без да се посочва естеството на използвания разтворител или разредител, се предполага, че трябва да се използва вода. Като общо правило водата трябва да бъде деминерализирана или дестилирана. В някои конкретни случаи, посочени в методите за анализ, тя трябва да се подложи на специални процедури или пречистване. 3. По отношение на обичайното оборудване в контролните лаборатории само специалните или изискващите специална употреба инструменти или апаратура се посочват в аналитичните методи. Те трябва да бъдат чисти, особено в случаите, когато се изследва наличието на вещества в много малки количества. В. Прилагане на методите за анализ и отразяване на резултатите 1. По принцип се възприема един метод за анализ на всяко вещество в храните за животни. Ако са възприети няколко различни метода, използваният от контролната лаборатория конкретен метод трябва да бъде посочен в отчета на резултатите от анализа. 2. Посоченият в отчета резултат от анализа трябва да представлява средна стойност, получена от минимум две процедури по установяване на вещества, при извършването на които са използвани две различни части на пробата с достатъчна повторяемост. Според регламентирания в метода за анализ начин този резултат се изразява чрез съответния брой значими цифри, като при необходимост се коригира спрямо водното съдържание на окончателната проба преди подготовката. МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ I. Метод за определяне на циановодородна киселина 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на циановодородната киселина, свободна и свързана под формата на гликозиди, в храни за животни и в частност в продукти, производни на ленено семе, брашно от маниока и някои видове бобови култури. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Циановодородната киселина се освобождава под действие на ензими, увлича се чрез парна дестилация и се събира в определен обем подкислен разтвор на сребърен нитрат. Сребърният цианид се разделя чрез филтруване и излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат. 3. Реактиви 3.1. Суспензия от сладки бадеми: счукват се двадесет сладки бланширани бадема в 100 ml вода с температура 37 до 40 °C. Необходима е увереност, че в 10 ml от суспензията няма циановодородна киселина, като се използва хартия от натриев пикрот или се извършва празна проба като описаната в последния абзац на т. 5. 3.2. 10% разтвор (w/v) на натриев ацетат, неутрален към фенолфталейн. 3.3. Емулсия на антипенител (напр. силикон) 3.4. Азотна киселина, d: 1,40. 3.5. Разтвор на сребърен нитрат – 0,02N. 3.6. Разтвор на амониев тиоцианат – 0,02N. 3.7. Наситен разтвор на амониев ферисулфат. 3.8. Амониев хидрооксид, d: 0,985. 4. Апаратура 4.1. Сушилня термостат, нагласен на 38°C. 4.2. Апарат за парна дестилация. 4.3. 1000 ml колби с плоско дъно със стъклена запушалка с шлиф. 4.4. Маслена баня. 4.5. Бюрета, градуирана на 1/20 ml. 5. Процедура Претеглят се 20 g от пробата с точност до 5 ml, поставят се в 1-литрова плоскодънна колба и се добавят 50 ml вода и 10 ml суспензия от сладки бадеми (3.1). Колбата се запушва и се поставя в сушилня при 38°C за 16 h. След това се охлажда до стайна температура и се добавят 80 ml вода, 10 ml разтвор на натриев ацетат (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Колбата се свързва към апарат за парна дестилация и се поставя в маслена баня, предварително доведена до температура малко над 100 °C. Дестилират се 200 до 300 ml течност, като се пуска мощен поток пара през колбата и внимателно се загрява маслената баня. Дестилатът се събира в ерленмайерова колба, защитена от светлината и съдържаща точно 50 ml 0,02 N (3.5) разтвор на сребърен нитрат и 1 ml азотна киселина (3.4). Необходимо е да се внимава краят на удължителя на хладника да е потопен в разтвора сребърен нитрат. Съдържанието се прехвърля на ерленмайеровата колба в 500 ml мерителна колба, допълва се с вода, разбърква се и се филтрува. Вземат се 250 ml от филтрата, добавят се около 1 ml разтвор на амониев ферисулфат (3.7) и се титрува обратно излишният сребърен нитрат с 0,02 N (3.6) разтвор на амониев тиоцианат от градуираната на 1/20 ml бюрета. Ако е необходимо, може да се направи празна проба чрез същата процедура, приложена към 10 ml суспензия на сладки бадеми (3.1), като пробата не се анализира. 6. Изчисляване на резултатите Ако празната проба покаже, че е бил погълнат 0,02N разтвор на сребърен нитрат, стойността на този обем се изважда от обема, погълнат от дестилата на пробата. 1 ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат отговаря на 0,54 mg HCN. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдение Ако пробата съдържа голямо количество сулфиди (напр. бобови култури), се образува черна утайка от сребърен сулфид, който се филтрува заедно с утайката от сребърен цианид. Образуването на тази утайка води до загуба на 0,02N сребърен нитрат, чийто обем трябва да се извади от обема, използван за изчисляването на съдържанието HCN. За тази цел: Утайката се обработва върху филтъра с 50 ml амониев хидрооксис (3.8), за да се разтвори сребърният цианид. Остатъкът се промива с разреден амониев хидрооксис и след това се определя сребърното му съдържание. Получената стойност се преобразува в ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат. Съдържанието HCN на пробата може да се определи и чрез титруване на подкисления амонячен филтрат с азотна киселина. II. Метод за определяне на калций 1. Цел и обхват Методът дава възможност да се определи общото съдържание на калций в храни за животни. 2. Принцип Калцият се опепелява, пепелта се обработва със солна киселина и калцият се утаява като калциев оксалат. Утайката се разтваря в сярна киселина и се титрува оксаловата киселина, която се получава с разтвор на калиев перманганат. 3. Реактиви 3.1. Солна киселина A.R., d: 1,14 3.2. Азотна киселина A.R., d: 1,40 3.3. Сярна киселина A.R., d: 1,13 3.4. Амониев хидрооксис A.R., d: 0,98 3.5. Студен наситен разтвор на амониев оксалат A.R. 3.6. 30% разтвор (w/v) лимонена киселина A.R. 3.7. 5% разтвор (w/v) амониев хлорид A.R. 3.8. 0,04% разтвор (w/v) бром-крезол зелено 3.9. 0,1N разтвор калиев перманганат 4. Апаратура 4.1. Електрическа муфелна пещ с въздушна циркулация и термостат. 4.2. Платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване. 4.3. Стъклени филтърни тигли с пористост G4. 5. Процедура 5 g от пробата или повече се претеглят (ако е необходимо) с точност до mg, като се накалява при 550 °C и се прехвърля пепелта в 250 mg бехерова чаша. Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), 60 ml вода и няколко капки азотна киселина (3.2). Довежда се до кипене и се задържа при температурата на кипене в продължение на тридесет минути. Охлажда се и разтворът се прехвърля в 250 ml мерителна колба. Промива се, обемът се довежда до мярката с вода, хомогенизира се и се филтрува. С помощта на пипета се прехвърля в 250 ml бехерова чаша аликвотна част, съдържаща 10 до 40 mg калций според предполагаемото калциево съдържание. Добавя се 1 ml разтвор на лимонена киселина (3.6) и 5 ml амониев хлорид (3.7). Обемът трябва да бъде до приблизително 100 ml с вода. Довежда се до кипене, добавя се 8 – 10 капки разтвор на бром-крезол зелено (3.8) и 30 ml горещ разтвор на амониев оксалат (3.5). Ако се получи утайка, тя се разтваря, като се добавят няколко капки солна киселина (3.1). Неутрализира се много бавно с амониев хидрооксис (3.4), като се бърка непрекъснато, докато pH стане 4,4 до 4,6, т.е. когато индикаторът смени цвета си. Бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се изчакват 30 min, така че образуваната утайка да падне на дъното. Бехеровата чаша се изважда от водната баня. Оставя се да престои един час и се филтрува през филтърен тигел G4. Бехеровата чаша и тигелът се промиват с вода до пълно отстраняване на излишния амониев оксалат (липсата на хлориди в промивните води показва, че промиването е достатъчно). Утайката се разтваря върху филтъра в 50 ml гореща сярна киселина (3.3). Тигелът се промива с гореща вода и филтратът се довежда до около 100 ml. Нагрява се до 70 – 80 °C и се титрува на капки с разтвор на калиев перманганат (3.9), докато се появи розово оцветяване, което се задържа една минута. 6. Изчисляване на резултатите 1 ml калиев перманганат 0,1N отговаря на 2,004 mg калций. Полученият резултат се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения 7.1. При много ниски съдържания на калций се процедира, както следва: утайката калциев оксалат се отфилтрува през свободна от пепели филтърна хартия. След промиване филтърът се изсушава и се накалява при 550 °C в платинов тигел. Остатъкът се разтваря отново в няколко капки сярна киселина (3.3), изпарява се до сухо, накалява се отново при 550 °C и се претегля. Ако W е теглото на получения калциев сулфат, калциевото съдържание на аликвотната част, взета като проба, е W.0,2944. 7.2. Ако пробата съдържа само минерални субстанции, се разтваря в солна киселина, без първоначално да се накалява. В случай на продукти, като например калциево-алуминиев фосфат, които трудно се разтварят в киселина, те се стопяват чрез алкален процес, преди субстанцията да се разтвори, както следва: пробата за анализ се смесва добре в платинов тигел със смес пет пъти теглото на пробата, която смес се състои от равни количества калиев карбонат и натриев карбонат. Внимателно се нагрява, докато сместа се стопи напълно. Охлажда се и се разтваря в солна киселина. 7.3. Ако магнезиевото съдържание на пробата е високо, калциевият оксалат се утаява втори път. III. Метод за определяне на карбонати 1. Цел и обхват Методът позволява определяне на количеството карбонати, които обикновено се изразяват като калциев карбонат, в повечето храни за животни. В някои случаи обаче (напр. с железен карбонат) трябва да се използва специален метод. 2. Принцип Карбонатите се разлагат в солна киселина; освободеният въглероден двуокис се събира в градуирана тръба и обемът му се сравнява с този, освободен при същите условия от познато количество калциев карбонат А.Р. 3. Реактиви 3.1. Солна киселина, d: 1,10 3.2. Калциев карбонат А.Р. 3.3. Сярна киселина, приблизително 0,1N, оцветена с метил червено 4. Апаратура Апарат Шайблер-Дитрих (вж. схемата) или равностоен на него 5. Процедура В зависимост от съдържанието карбонати в пробата част от пробата се претегля, както е посочено: – 0,5 g за продукти, съдържащи от 50 до 100% карбонати, изразени като калциев карбонат; – 1 g за продукти, съдържащи от 40 до 50% карбонати, изразени като калциев карбонат; – 2 до 3 g за други продукти. Частта от пробата се поставя в специалната колба 4 на апарата, снабдена с малка тръбичка от нетрошлив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (3.1), и колбата се свързва с апарата. Трипътният кран се завърта 5, така че тръбата 1 да се свързва откъм външната страна. Като се използва подвижната тръба 2, която е пълна с оцветена сярна киселина (3.3) и свързана към градуираната тръба 1, нивото на течността се довежда до нулевата марка. Кранът 5 се завърта, така че тръбите 1 и 3 да се свържат. Необходимо е да се провери дали нивото е на нула. Солната киселина (3.1) се довежда бавно върху частта от пробата, като се накланя колбата 4. Налягането се изравнява, като тръбата 2 се сваля надолу. Колбата 4 се бълника дотогава, докато престане напълно отделянето на въглероден двуокис. Налягането се възстановява, като се въвежда течността отново до едно и също ниво в тръби 1 и 2. След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането. Необходимо е да се направи контролна проба при същите условия с 0,5 g калциев карбонат (3.2). 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието в грамове карбонати, изразено като % калциев карбонат в пробата, се изчислява по формулата: \frac{V.100}{T.2W} където: V e ml CO2, отделено на порция от пробата; T – ml CO2, отделено при 0,5g CaCO3 А.Р.; W – теглото на порцията от пробата, в грамове. 7. Наблюдения 7.1. Когато частта от пробата тежи повече от 2 g, първо се поставя 15 ml дестилирана вода в колбата 4 и се смесва преди началото на анализа. Същият обем вода се използва за контролната проба. 7.2. Ако използваният апарат има обем, различен от този на апарата Шайблер-Дитрих, частта, взета от пробата и от контролната субстанция, и изчисляването на резултатите трябва да се пригодят съответно. IV. Метод за определяне на сурова пепел 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на сурова пепел в храни за животни. 2. Принцип Пробата се накалява при 550 °C; остатъкът се претегля. 3. Реактиви 20% разтвор (w/v) на амониев нитрат 4. Апаратура 4.1. нагревателна плоча 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат 4.3. тигли за накаляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10 % Pt, 90 % Au), правоъгълни (60 × 40 × 25mm) или кръгли (диаметър 60 до 75mm, височина 20 до 25mm). 5. Процедура Около 5 g от пробата (2,5 при продукти, които имат склонност да набъват) се претеглят с точност до mg и се поставят в тигел за накаляване, който е бил предварително накален и тариран. Тигелът се поставя върху нагревателна плоча и се нагрява постепенно, докато субстанцията се овъгли. Тигелът се поставя в муфелна пещ, нагласена на 550^{\circ}\text{C} \pm 50^{\circ}\text{C}. Задържа се при тази температура дотогава, докато се получи бяла, светлосива или червеникава пепел, която изглежда свободна от карбонатсъдържащи частици. Тигелът се поставя в ексикатор, оставя се да се охлади и се претегля незабавно. 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като се извади тарираното тегло. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения 7.1. Пепелта на субстанции, които трудно се опепеляват, трябва да бъде подложена на първоначално накаляване в продължение на поне три часа, да се охлади и след това да се добавят няколко капки 20% разтвор на амониев нитрат (внимателно, за да се избегне разпрашаването на пепелта или образуването на бучици). Накаляването продължава след изсушаване в сушилнята. Операцията се повтаря колкото се налага, за да стане пълно опепеляване. 7.2. При субстанции, устойчиви към обработката, описана в 7.1, се процедира, както следва: след накаляване за 3 часа пепелта се поставя в гореща вода и се филтрува през малък, свободен от пепели филтър. Филтърът и съдържанието му се опепеляват в първоначалния тигел. Филтратът се поставя в охладен тигел, изпарява се до сухо, опепелява се и се претегля. 7.3. В случай на масла и мазнини една проба от около 25 g се претегля в подходящ по размери тигел. Субстанцията се карбонизира, като пламъкът се поднася към нея с парче свободна от пепели филтърна хартия. След изгарянето се навлажнява с колкото е възможно по-малко вода, изсушава се и се опепелява, както е описано в т. 5. V. Метод за определяне на пепел, която е неразтворима в солна киселина 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на количеството минерални субстанции, неразтворими в солна киселина, в храни за животни. В зависимост от естеството на пробата могат да се приложат два метода: 1.1. метод A – приложим към прости органични храни за животни и към повечето съставни храни за животни; 1.2. метод Б – приложим към минерални вещества и смеси и към съставни храни за животни, чието съдържание субстанции, неразтворими в солна киселина, определено по метод A, е по-голямо от 1%. 2. Принцип 2.1. метод A – пробата се опепелява, пепелта се кипва в солна киселина и неразтворимият остатък се филтрува и претегля; 2.2. метод Б – пробата се обработва със солна киселина; разтворът се филтрува, остатъкът се опепелява и така получената пепел се обработва по метод A. 3. Реактиви 3.1. солна киселина 3N; 3.2. 20% разтвор (w/v) трихлороцетна киселина; 3.3. 1% разтвор (w/v) на трихлороцетна киселина. 4. Апаратура 4.1. гореща плоча; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат 4.3. тигли за опепеляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10% Pt, 90% Au), правоъгълни (60 \times 40 \times 25 mm) или кръгли (диаметър 60 до 75 mm, височина 20 до 25 mm). 5. Процедура 5.1. метод A: Пробата се опепелява по метода, описан за определянето на сурова пепел. Може да се използва и пепелта, получена от този анализ. Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна киселина 3N (3.1). Довежда се бавно до кипене спокойно в продължение на 15 min. Горещият разтвор се филтрува през филтърна хартия, свободна от пепели, и се промива остатъкът с гореща вода до липса на видима киселинна реакция. Филтърът се изсушава с остатъка и се опепелява в тариран тигел при температура не по-ниска от 550^{\circ}\text{C} и не по-висока от 700^{\circ}\text{C}. Охлажда се в ексикатор и се претегля. 5.2. метод Б: 5 g от пробата с точност до mg се претегля и се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша. Добавят се последователно 25 ml вода и 25 ml солна киселина 3N (3.1), смесват се и се изчаква да престане кипенето. Добавят се още 50 ml солна киселина 3N (3.1). Изчаква се да спре отделянето на газ и след това бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се оставя там в продължение на 30 min или по-дълго, ако се налага, за да се хидролизира напълно и нишестето, което може да присъства. Филтрува се, докато пробата е гореща, през филтър, свободен от пепел, и филтърът се промива с 50 ml гореща вода (вж. наблюдение 7). Филтърът с остатъка се поставят в тигел за опепеляване, изсушава се и се опепелява при температура не по-ниска от 550^{\circ}\text{C} и не по-висока от 700^{\circ}\text{C}. Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна киселина 3N (3.1); продължава се, както е описано във втория абзац на 5.1. 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като тарираното тегло се изважда. Резултатът се изразява в проценти за пробата. 7. Наблюдение Ако филтруването се окаже трудно, за подновяване на анализа 50-те ml солна киселина 3N (3.1) се заместват с 50 ml 20% трихлороцетна киселина (3.2) и филтърът се промива с горещ 1 % разтвор на трихлороцетна киселина (3.3). VI. Метод за определяне на хлор от хлориди 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието хлор в хлориди, които са разтворими във вода, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим към всички храни за животни. 2. Принцип Хлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се избистря. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата на сребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард. 3. Реактиви: 3.1. разтвор на амониев тиоцианат 0,1N; 3.2. разтвор на сребърен нитрат 0,1N; 3.3. наситен разтвор на амониев ферисулфат; 3.4. азотна киселина D:1.38; 3.5. диетилов етер A.R.; 3.6. ацетон A.R.; 3.7. Карез I разтвор: разтваря се във вода 21,9 g цинков ацетат, Zn(CH_3COO)_2 \cdot 2H_2O и 3 g ледена оцетна киселина. Допълва се до 100 ml с вода; 3.8. Карез II разтвор: разтваря се 10,6 g калиев фероцианид, K_4Fe(CN)_6 \cdot 3H_2O. Допълва се до 100 ml с вода; 3.9. активен въглен A.R., свободен от хлориди и неабсорбиращ хлориди. 4. Апаратура клатачна машина (Шутел): прибл. 35 до 40 оборота в min. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора Според естеството на пробата се приготвя разтвор, както е показано в 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3. Същевременно е необходимо да се направи празна проба без подлежащото на анализ вещество. 5.1.1. Проби, свободни от органични вещества Претегля се с точност до mg една проба от не повече от 10 g, съдържаща не повече от 3 g хлор под формата на хлориди. Поставя се с 400 ml вода в 500 ml мерителна колба при приблизително 20°C. Разклаща се 30 min в шутела, довежда се до марката, хомогенизира се и се филтрува. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без продуктите, описани в 5.1.3. Претегят се около 5 g от пробата с точност до mg и се поставят с 1 g активен въглен в 500 mg мерителна колба. Добавят се 400 ml вода с температура около 20°C и 5 ml разтвор I Карез (3.7), разбъркват се и после се добавят 5 ml разтвор II Карез (3.8). Разклаща се 30 min в шутела, довежда се до марката, хомогенизира се и се филтрува. 5.1.3. Готвени храни за животни, ленено кюспе и брашно, продукти, богати на ленено брашно, и други продукти, богати на растителен клей или в колоидални субстанции (например декстринирано нишесте). Разтворът се приготвя, както е описано в 5.1.2, но не се филтрува. Декантира се (ако се налага, се центрофугира), изваждат се 100 ml от бистрата течност и се прехвърлят в 200 ml мерителна колба. Смесва се с ацетон (3.6) и се довежда до марката с този разтворител, хомогенизира се и се филтрува. 5.2. Титруване С помощта на пипета се прехвърлят в ерленмайерова колба от 25 ml до 100 ml от филтрата (в зависимост от предполагаемото хлорно съдържание), получен, както е описано в 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3. Аликвотната част не трябва да съдържа повече от 150 mg хлор (Cl). Разрежда се, ако се налага, до не по-малко от 50 ml с вода, добавят се 5 ml азотна киселина (3.4), 20 ml наситен разтвор на амониев ферисулфат (3.3) и две капки разтвор на амониев тиоцианат (3.1). Прехвърля се с помощта на бюрета, запълнена до нулевата марка. С помощта на бюрета разтворът се прехвърля на сребърния нитрат (3.2) по такъв начин, че да се получи излишък от 5 ml. Добавят се 5 ml диетилов етер (3.5) и се разбъркват силно (шейкър), за да коагулира утайката. Титрува се излишният сребърен нитрат с разтвора на амониевия тиоцианат (3.1) дотогава, докато червено-кафеникавото оцветяване се задържи 1 min. 6. Изчисляване на резултатите Количеството хлор (w), изразено като натриев хлорид, налично в обема на филтрата, взет за титруване, се изчислява по следната формула: W = 5,845 (V_1 - V_2) \text{ mg}, където: V_1 е добавеният разтвор на сребърен нитрат C,1 N, ml; V_2 – разтворът на амониев тиоцианат 0,1N, използван за титруване, ml. Ако празната проба показва, че разтворът на сребърен нитрат 0,1N е изчерпан, тази стойност се приспада от обема (V_1 - V_2). 7. Наблюдения 7.1. Титруването може да се извърши и потенциометрично. 7.2. При продукти, които са много богати на масла и мазнини, първо се обезмаслява с диетилов етер или петролеев етер; 7.3. При рибна храна титруването може да се извърши по метода на Мор. VII. Метод за определяне на горчично масло 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието горчично масло в кейкове от brassica и sinapis видовете и в съставни храни, които съдържат кейкове, приготвени от тези видове, изразено като алил изотиоцианат, който може да бъде уловен с пара. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Горчичното масло се освобождава под действието на ензими, улавя се чрез дестилация с етанол и се събира в разреден амоняк. Разтворът се обработва на горещо с определен обем сребърен нитрат, след което се охлажда и филтрува. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат. 3. Реактиви 3.1. бял синап (sinapis alba); 3.2. 95 до 96% етанол (v/v); 3.3. антипенителна емулсия (напр. силикон); 3.4. амониев хидрооксид, d: 0,958; 3.5. разтвор на сребърен нитрат 0,1N; 3.6. разтвор на амониев тиоцианат 0,1N; 3.7. азотна киселина D: 1,40; 3.8. наситен разтвор на амониев ферисулфат. 4. Апаратура: 4.1. плоскодънни 500 ml колби със стъклени запушалки с шлиф; 4.2. дестилационен апарат с хладник и съоръжение, предотвратяващо улавянето на капки. 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до mg, поставят се в 500 ml плоскодънна колба и се добавят 2 g фино смлян бял синап (3.1) (източник на ензим) и 200 ml вода с температура 20°C. Колбата се запушва и се държи при температура 20°C около 2 h, като често се разклаща. Добавят се 40 ml етанол (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Дестилират се около 150 ml и се събира дестилатът в 250 ml мерителна колба, съдържаща 20 ml амониев хидрооксид (3.4), като се внимава краят на хладника да е потопен в течността. Добавят се към амонячния разтвор 50 ml 0,1N разтвор на сребърен нитрат (3.5) (или повече, ако се налага). Поставя се малка фунийка върху мерителната колба и сместа се нагрява на кипяща водна баня един час. Оставя се да се охлади, допълва се до марката с вода, разбърква се и се филтрува. Изваждат се 100 ml от бистрия филтрат, добавят се 5 ml азотна киселина (3.7) и около 5 ml амониев ферисулфат (3.8). Титрува се излишният сребърен нитрат с 0,1N разтвор на амониев тиоцианат (3.6). Прави се празна проба по същата процедура с 2 g фино смлян бял синап, без пробата за анализ. 6. Изчисляване на резултатите Обемът 0,1N сребърен нитрат се изважда, поет от празната проба, от обема, поет от пробата. Получената стойност дава броя ml сребърен нитрат 0,1N, поет от горчичното масло в пробата. 1 ml AgNO3 0,1N отговаря на 4,956 mg алил изотиоцианат. Резултатът се извежда като проценти за пробата. VIII. Метод за определяне на лактоза 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието лактоза в храни за животни, съдържащи повече от 0,5% лактоза. 2. Принцип Захарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под действие на saccharomyces cerevisiae, които дрожди не засягат лактозата. След избистряне и филтруване съдържанието лактоза във филтрата се определя по метода Луф-Шорл. 3. Реактиви: 3.1. суспензия на saccharomyces cervisiae – суспендират се 25 g пресни дрожди в 100 ml вода. Суспензията издържа максимум една седмица в хладилник; 3.2. разтвор Карез I – разтварят се във вода 21,9 цинков ацетат Zn(CH3COO)22H2O и 3 g ледена оцетна киселина, допълват се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II – разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K4Fe(CN6)3H2O, допълват се до 100 ml с вода; 3.4. реагент на Луф-Шорл: С внимателно разбъркване се изсипва лимонена киселина (3.4.2) в разтвора натриев карбонат (3.4.2); добавя се разтвора меден сулфат (3.4.1) и се допълва до 1 l с вода, оставя се да престои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив (Cu 0,1N; Na2CO3 2N). pH на разтвора трябва да е приблизително 9,4; 3.4.1. разтвор на меден сулфат – разтварят се 25 g меден сулфат A.R. CuSO4.5H2O, свободен от желязо, в 100 ml вода; 3.4.2. разтвор на лимонена киселина: разтварят се 50 g лимонена киселина A.R. C6H8O7, H2O в 50 ml вода; 3.4.3. разтвор на натриев карбонат: разтварят се 143,8 g безводен натриев карбонат A.R. в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади; 3.5. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена; 3.6. 30% разтвор (w/v) натриев йодид; 3.7. 6 N сярна киселина; 3.8. 0,1N разтвор на натриев тиосулфат; 3.9. нишестен разтвор – прибавя се смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода към 11 кипяща вода; кипва се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант. 4. Апаратура Водна баня с термостат, нагласен на 3 – 40°C 5. Процедура Претегля се 1 g от пробата с точност до mg и се поставя тази порция от пробата в 100 ml мерителна колба. Добавят се 25 до 30 ml вода. Поставя се колбата в кипяща водна баня за 30 min и след това се охлажда до приблизително 35°C. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (3.1) и се хомогенизира. Оставя се колбата да престои 2 h на водна баня при температура 38 – 40 °C. Охлажда се до около 20 °C. Добавят се 2,5 ml разтвор Карез I (3.2), бърка се 30 sec, след това се добавят 2,5 ml разтвор Карез II (3.3) и отново се бърка 30 sec. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и се филтрува. С помощта на пипета се взема част от филтрата – не повече от 25 ml и за предпочитане със съдържание на лактоза от 40 до 80 ml – и се прехвърля в 300 ml ерленмайерова колба. Ако е необходимо, допълва се до 25 ml с вода. Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1). Съдържанието на лактоза по метода на Луф-Шорл се определя, както следва: прибавят се точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (3.5). Бърка се на ръка, докато се нагрява на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху телена мрежа с отвор около 6 cm в диаметър, покрита с азбест, под която е запален пламък. Пламъкът се регулира така, че да се нагрява само основата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина 6N (3.7); титрува се с разтвор на натриев тиосулфат 0,1N (3.8) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (3.9) и се завършва титруването. Извършва се същото титруване с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и 25 ml сярна киселина 6N (3.7) без кипене. 6. Изчисляване на резултатите На базата на приложената таблица се определя количеството лактоза в mg, което съответства на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml на тиосулфатен разтвор 0,1 N. Резултатът се изразява като части от дехидратирана лактоза в процент от пробата. 7. Наблюдения За продукти, съдържащи повече от 40% ферментируема захар, се използват повече от 5 ml дрождена суспензия (3.1). Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O} Глюкоза, фруктоза, инвертни захари \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 Лактоза \text{C}_{12}\text{H}_{22}\text{O}_{11} Малтоза \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O} mg разлика mg разлика mg разлика ml ml ml ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 80,0 94,6 23 IX. Метод за определяне на калий 1. Цел и обхват Този метод позволява определяне на количеството калий в храни за животни. 2. Принцип Пробата се накалява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции до голяма степен елиминира преченето от примесващи се елементи. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина A.R., d:1,12; 3.2. цезиев хлорид A.R.; 3.3. алуминиев нитрат Al (\text{NO}_3)3.9H2O, реагент за общо приложение; 3.4. калиев хлорид, безводен A.R.; 3.5. пълнител – във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се и 250 g алуминиев нитрат(3.3), разрежда се до 11 c вода и се хомогенизира. Съхранява се в пластмасови шишета; 3.6. стандартен калиев разтвор – във вода се разтваря 1,907 g калиев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира, съхранява се в пластмасови шишета, 1 ml от този разтвор съдържа 1,00 ml калий. 4. Апаратура: 4.1. платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени (ако се налага) с капаци; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат; 4.3. пламъчен фотометър. 5. Процедура: 5.1. Анализ на пробата Като общовалидно правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставя се в тигел и се опепелява при 450°C в продължение на 3 h. След охлаждане пепелта се прехвърля количествено в 500 ml мерителна колба, като се използват от 250 до 300 ml вода и след това 50 ml солна киселина (3.1). Когато отделянето на въглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се държи при температура около 90°C в продължение на 2 h, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайна температура се допълва до марката с вода, разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърля една аликвотна част от филтрата, съдържаща максимум 1,0 ml калий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. В случай на по-големи съдържания на калий разтворът, подлежащ на анализ, се разрежда в подходящо съотношение, преди да се прибави пълнителят. Като насока за проба от около 10 g се ползва таблицата: Предполагаемо съдържание на калий в пробата (% K) Разтворимост Аликвотна част от разтвора в ml до 0.1 - 50 от 0.1 до 0.5 - 10 от 0.5 до 1.0 - 5 от 1.0 до 5.0 1:10 10 от 5.0 до 10.0 1:10 5 от 10.0 до 20.0 1:20 5 5.2. Калибрираща крива Поставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно на количества калий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор. Към всяка колба се добавя по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерванията се извършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрация на калий от 1 mg в 100 ml разтвор. 6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения За да се елиминира влиянието на примесващи елементи, невинаги се налага да се прибавя пълнител (3.5). X. Метод за определяне на натрий 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието натрий в храни за животни. 2. Принцип Пробата се опепелява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции в голяма степен елиминира влиянието на примесни елементи. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина A.R. d:1.12; 3.2. цезиев хлорид A.R.; 3.3. алуминиев нитрат Al (\text{NO}_3)3.9H2O, реагент за общо приложение; 3.4. натриев хлорид, безводен A.R.; 3.5. пълнител – във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се 250 g алуминиев нитрат (3.3), разрежда се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета; 3.6. стандартен натриев разтвор – във вода се разтварят 1,907 g натриев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета; 1 ml от този разтвор съдържа 1,00 mg натрий. 4. Апаратура: 4.1. платинени, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени, ако се налага, с капаци; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат; 4.3. пламъчен фотометър. 5. Процедура: 5.1. Анализ на проба Като общо правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставят се в тигел (4.2) и се опепеляват при 450°C за 3 h. Препоръчително е да се избягва прегряване (възпламенаване). След охлаждане пепелта се прехвърля количествено в 500 ml мерителна колба, като се използват 250 – 300 ml вода и след това 50 ml солна киселина (3.1). Когато отделянето на въглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се оставя при температура около 90°C в продължение на два часа, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайна температура се допълва до марката с вода, разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърля една аликвотна част от филтрата, съдържаща максимум 1,0 mg натрий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. В случай на по-големи съдържания натрий разтворът, подлежащ на анализ, се разрежда в подходящо съотношение, преди да се прибави пълнителят. Като насока за проба от около 10 g се ползва следната таблица: Предполагаемо съдържание на натрий в пробата (% N) Разтворимост Аликвотна част от разтвора в ml до 0.1 - 50 от 0.1 до 0.5 - 10 от 0.5 до 1.0 - 5 от 1.0 до 5.0 1:10 10 от 5.0 до 10.0 1:10 5 от 10.0 до 20.0 1:20 5 5.2. Калибрираща крива Поставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно на количества натрий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор. Към всяка колба се добавят по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерванията се извършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрация натрий 1 mg в 100 ml разтвор. 6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения: 7.1.3a продукти, съдържащи повече от 4% натрий, е за предпочитане да се опепели субстанцията за 2 h в тигел с капак. След охлаждане се добавя вода, пепелта се превръща в суспензия с помощта на платиново телче, изсушава се и се опепелява отново за 2 h в тигела с капак. 7.2. Ако пробата се състои само от минерални субстанции, тя се разтваря без предварително опепеляване. XI. Метод за определяне на захар 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия, изразени като глюкоза или, когато е подходящо, като захараза, преобразувано с коефициент 0,95. Той е приложим към съставни храни за животни. За другите храни за животни са предвидени специални методи. Когато се налага, лактозата трябва да се измерва отделно и да се отчита при изчисляването на резултатите. 2. Принцип Захарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл. 3. Реактиви: 3.1. 40% етанол (v/v) d: 0,948 при 20°C, неутрализиран спрямо фенолфталейн; 3.2. Карез разтвор I – във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат Zn(CH_3COO)_2 \cdot 2H_2O и 3 g ледена оцетна киселина, допълва се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II – във вода се разтварят 10,6 g калиев фероцианид K_4Fe(CN_6)_3 \cdot 2H_2O, допълва се до 100 ml с вода; 3.4. 0,1% разтвор (w/v) метилоранж; 3.5. 4N солна киселина; 3.6. 0,1N солна киселина; 3.7. 0,1N разтвор на натриев хлорид; 3.8. реагент на Луф-Шорл – при внимателно разбъркване се изсипва разтворът на лимонената киселина (3.8.2) в разтвора на натриевия карбонат (3.8.3); добавя се разтворът на меден сулфат (3.8.1) и се допълва до 1 l с вода; оставя се да престои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив (Cu 0,1N; Na_2CO_3 2N). pH на разтвора би трябвало да има стойност приблизително 9,4; 3.8.1. разтвор на меден сулфат – в 100 ml вода се разтварят 25 g меден сулфат A. R. CuSO_4 \cdot 5H_2O, несъдържащ желязо; 3.8.2. разтвор на лимонена киселина – в 50 ml вода се разтварят 50 g лимонена киселина A. R. C_6H_8O_7 \cdot 2H_2O; 3.8.3. разтвор на натриев карбонат – в около 300 ml гореща вода се разтварят 143,8 g безводен натриев карбонат A. R.; оставя се да се охлади; 3.9. 0,1N разтвор на натриев тиосулфат; 3.10. нишестен разтвор – смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода се прибавя към 1 l кипяща вода; кипи се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант; 3.11. 6N сярна киселина; 3.12. 30% разтвор (w/v) калиев йодид; 3.13. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена; 3.14. 3-метилбутан-L-ол. 4. Апаратура: Миксер (барабан) – приблизително 35 до 40 оборота в min. 5. Процедура 5.1. Екстрахиране на пробата Претеглят се 2,5 g от пробата с точност до mg и се поставят в 250 ml мерителна колба. Добавят се 200 ml етанол (3.1) и се смесват в барабана за 1 h. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и се разбърква 1 min. Добавя се разтвор на Карез II (3.3) и отново се разбърква 1 min. Допълва се до марката с етанол (3.1), хомогенизира се и се филтрува. Отделят се 200 ml от филтрата и се изпарява до почти половината обем, за да се отстрани по-голямата част от етанола. Остатъкът се прехвърля след изпаряването количествено в 200 ml мерителна колба с помощта на гореща вода, охлажда се, допълва се до марката с вода, хомогенизира се и се филтрува, ако се налага. Този разтвор ще се използва за определянето на количеството редукторни захари и след инверсия, на общите захари. 5.2. Определяне на редукторни захари С помощта на пипета се вземат не повече от 25 ml от разтвора, съдържащ по-малко от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допълва до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентно съдържание на глюкоза в пробата. 5.3. Определяне на общи захари след инверсия С помощта на пипета се взимат 50 ml от разтвора и се прехвърлят в 100 ml мерителна колба. Добавят се няколко капки разтвор на метилоранж (3.4), след това внимателно и с непрекъснато бъркане се добавят 4N солна киселина (3.5), докато течността стане определено червена. Добавят се 15 ml 0,1N солна киселина (3.6), колбата се потапя в силно кипяща водна баня и се оставя 30 min. Охлажда се бързо до около 20°C и се добавят 15 ml 0,1N разтвор на натриев хидроокис (3.7). Допълва се до 100 ml с вода и се хомогенизира. Взимат се не повече от 25 ml, съдържащи по-малко от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допълва до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентни глюкоза или когато е подходящо – захароза, като се умножава по коефициент 0,95. 5.4. Титруване по метода на Луф-Шорл С помощта на пипета се взимат 25 ml от реагента на Луф-Шорл (3.8) и се прехвърлят в 300 ml ерленмайерова колба; добавят се точно 25 ml от избистрения захарен разтвор. Добавят се 2 гранули пемза (3.13), нагрява се с бъркане на ръка на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Необходимо е пламъкът да се регулира по такъв начин, че да се нагрява само основата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: Добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят и 25 ml 6N сярна киселина (3.11). Титрува се с 0,1N разтвор на натриев тиосулфат (3.9), докато се появи мътно жълто оцветяване, добавя се и нишестеният индикатор (3.10) и титруването се завършва. Същото титруване се извършва с точно премерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.8) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и 25 ml 6N сярна киселина (3.11), без кипене. 6. Изчисляване на резултатите С помощта на таблицата се установява количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между стойностите на двете титрувания, изразена в mg натриев тиосулфат 0,1N. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Специални процедури 7.1. В случай на храни за животни, богати на меласа, и други храни, които не са особено хомогенни, се претеглят 20 g и се поставят в 500 ml вода в мерителна колба от 11. Разбърква се един час в барабан. Избистря се с реагенти Карез I и II (3.2 и 3.3), както е описано в 5.1, като се използват четирикратни количества от всеки реагент. Допълва се до марката с 80% етанол (v/v). Хомогенизира се и се филтрува. Отстранява се етанолът, както е описано в 5.1. Ако няма декстринизирано нишесте, се допълва до марката с дестилирана вода. 7.2. В случай на меласа и прости храни за животни, които са богати на захар и почти не съдържат нишесте (рожкови, сушено цвекло и др.), се претеглят 5 g, поставят се в 250 ml мерителна колба, добавят се 200 ml дестилирана вода и се бълника в барабан 1 h или повече, ако се налага. Избистря се с помощта на реагенти Карез I (3.2) и Карез II (3.3), както е описано в 5.1. Допълва се до марката със студена вода, хомогенизира се и се филтрува. За да се определи количеството общи захари, се процедира по описанието в 5.3. 8. Наблюдения 8.1. За да се избегне образуването на пяна, е добре да се добави (независимо от обема) приблизително 1 ml 3-метилбутан-L-ол (3.14) преди кипенето с реагент на Луф-Шорл. 8.2. Разликата между съдържанието на общи захари след инверсия, изразени като глюкоза, и съдържанието на редукторни захари, изразени като глюкоза, умножена по 0,95, дава процентното съдържание захароза. 8.3. За да се определи съдържанието на редукторните захари, без лактозата, може да се използват два метода: 8.3.1. за приблизително изчисляване се умножава по 0,675 съдържанието на лактоза, установено по друг аналитичен метод, и полученият резултат се изважда от съдържанието на редукторните захари; 8.3.2. за точно изчисление на редукторни захари, без лактоза, за двете крайни определения може да се използва една и съща проба: единият анализ се прави с част от разтвора, получен по 5.1, а другият – с част от разтвора, получен при определянето на лактоза по метода, посочен за тази цел (след фермениране на другите видове захар и избистряне). И в двата случая количеството налична захар се определя по метода на Луф-Шорл и се изчислява в mg глюкоза. Едната от стойностите се изважда от другата и разликата се изразява в проценти за пробата. Пример: Двата взети обема за всяко определение отговарят на проба от 250 mg. В първия случай се консумират 17 ml натриев тиосулфатен разтвор 0,1N, отговарящи на 44,2 mg глюкоза; във втория – 11 ml, отговарящи на 27,6 mg глюкоза. Разликата е 16,6 mg глюкоза. Съдържанието редукторни захари (без лактоза), изчислено като глюкоза по този начин, е: 4,16,6 \frac{\text{ml}}{\text{mg}} = 6,64 \% . 10 Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_8, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_8 Глюкоза, фруктоза, инвертни захари \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 Лактоза \text{C}_{12}\text{H}_{22}\text{O}_{11} Малтоза \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_8 ml mg разлика mg разлика mg разлика 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 80,0 94,6 23 XII. Метод за определяне на карбамид 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието карбамид в храни за животни. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрува. Съдържанието карбамид във филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичната плътност при дължина на вълната 420 nm. 3. Реактиви: 3.1. разтвор на 4-диметиламинобензалдехид – в 100 ml 96% етанол се разтварят 1,6 g 4-DMAB A.R. и се добавят 10 ml солна киселина A.R. (d: 1,19); този реактив се съхранява максимално две седмици; 3.2. Карез разтвор I – във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат \text{Zn}(\text{CH}_3\text{COO})_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O} и 3 g ледена оцетна киселина; допълва се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II – във вода се разтварят 10,6 g калиев фероцианид \text{K}_4\text{Fe}(\text{CN}_6)_3 \cdot 2\text{H}_2\text{O}; допълва се до 100 ml с вода; 3.4. активен въглен A.R., който не абсорбира карбамид (да се провери); 3.5. 0,1% разтвор (w/v) карбамид A.R. 4. Апаратура: 4.1. миксер (барабан) – приблизително 35 до 40 оборота в min; 4.2. епруветки – 160 \times 16 mm със стъклени запушалки с шлиф; 4.3. спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Анализ на проба Претеглят се 2 g проба с точност до mg и се поставят с 1 g активен въглен (3.4) в 500 ml мерителна колба. Добавят се 400 ml вода и по 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и разтвор на Карез II (3.3). Разбъркват се 30 min в барабан. Допълва се до марката с вода, разклаща се и се филтрува. Взимат се 5 ml от прозрачните безцветни филтрати, поставят се в епруветки със стъклени запушалки с шлиф, добавят се 5 ml 4-DMAB разтвор (3.1) и се смесва. Епруветките се поставят в гореща водна баня при 20^\circ\text{C}. След 15 min се измерва оптичната плътност на изследвания разтвор със спектрофотометър при 420 nm. Сравнява се с празната проба от реактиви. 5.2. Калибрираща крива Взимат се обеми от 1, 2, 4, 5 и 10 ml от карбамидния разтвор (3.5), поставят се в 100 ml мерителни колби и се допълват до марката с вода. Взимат се по 5 ml от всеки разтвор, добавят се 5 ml 4-D:AB (3.1) разтвор към всяка от тях, хомогенизира се и се измерва оптичната плътност, както е показано по-горе, в сравнение с контролен разтвор, съдържащ 5 ml 4-DMAB и 5 ml вода, свободна от карбамид. Построява се калибриращата крива. 6. Изчисляване на резултатите Количеството карбамид в пробата се определя, като се използва калибриращата крива. Резултатът се изразява в проценти за пробата. 7. Наблюдения 7.1. В случай на съдържание карбамид над 3%, пробата се намалява до 1 g или първоначалният разтвор се разрежда така, че да няма повече от 50 mg карбамид в 500 ml. 7.2. В случай на ниско съдържание карбамид пробата се увеличава дотогава, докато филтратът остава прозрачен и безцветен. 7.3. Ако пробата съдържа просто азотно съединение (например аминокиселини), оптичната плътност трябва да се измерва при 435 nm. XIII. Изчисляване на уреазната активност на продукти, производни на соята 1. Цел и обхват Анализът позволява да се изчисли уреазната активност на продукти, производни на соята, и да се провери дали тези продукти са били обработени достатъчно добре. 2. Принцип Уреазната активност се изчислява чрез количеството амонячен азот, освободено от 1 g продукт за минута при 30^\circ\text{C} от разтвор на карбамид. 3. Реактиви: 3.1. 0,1N солна киселина; 3.2. 0,1N натриев хидроокис; 3.3. фосфатен буфер (натриева основа) 0,05, съдържащ на 1000 ml 4,45 g двунатриев фосфат (\text{Na}_2\text{HPO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}) и 3,40 g монокалиев фосфат (\text{KH}_2\text{PO}_4); 3.4. прясно приготвен карбамиден пълнител, съдържащ 30,0 g карбамид на 1000 ml фосфатен буфер (3.3); pH 6,9 – 7,0. 4. Апаратура: 4.1. апарат за потенциометрично титруване или високочувствителен pH-метър (0,02pH) с магнитна бъркалка; 4.2. водна баня с термостат, нагласен точно на 30 °C; 4.3. епруветки със стъклени запушалки с шлиф, 150 \times 18\text{mm}. 5. Процедура Около 10 g от пробата се смилат (напр. в мелничка за кафе) така, че да преминават през сито с отвори 0,2 mm. Претеглят се 0,2 g от смляната проба с точност до mg, поставят се в епруветка със стъклена запушалка с шлиф и се добавят 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Запушва се веднага и енергично се разклаща. Епруветката се поставя на водна баня, нагласена точно на 30°C, и се разклаща енергично. Епруветката се поставя на водна баня, точно на 30°C и се задръжа там 30 min. Веднага се добавят 10 ml от 0,1N солна киселина (3.1), охлажда се бързо до 20°C и съдържанието на епруветката се прехвърля количествено в съд за титруване, като се промива два пъти с по 5 ml вода. С помощта на стъклен електрод (4.1) се титрува веднага до pH 4,7 с 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) чрез електрометрия. Празна проба се приготвя, както следва: Проба от 0,2 g, претеглена с точност до mg, се поставя бързо в епруветка със стъклена запушалка с шлиф, добавят се 10 ml 0,1N солна киселина (3.1) и след това 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Епруветката се охлажда веднага в ледена вода и се оставя в нея 30 min. При тези условия се извършва прехвърляне на съдържанието на епруветката в съда за титруване, като се използва 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) до pH 4,7. 6. Изчисление: Уреазната активност се изчислява по формулата 1 ml от 0,1 N \text{NaOH} = 18\text{ mg} теобромин. 7. Наблюдение: 7.1. Този метод е подходящ за уреазна активност до 1 mg N/G/min при 30 °C. За продукти с по-голяма активност размерът на пробата трябва да се намали на 50 g. 7.2. Продукти, съдържащи повече от 10% сурови мастни вещества, трябва първо да бъдат обезмаслени на студено. XIV. Метод за определяне на суров протеин 1. Цел и обхват: Чрез този метод може въз основа на съдържанието на азот, измерен по метода на Kjeldahl, да се определи съдържанието на суровия протеин в продукти за изхранване на животни. 2. Принцип: Пробата се разлага чрез мокро изгаряне. Киселият разтвор се неутрализира с разтвор на натриева основа. Отделеният амоняк се улавя чрез дестилация и се събира в известно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува с разтвор на натриева основа. 3. Реактиви: 3.1. калиев сулфат ч.з.а.; 3.2. катализатор – меден окис \text{CuO}, ч.з.а. или прекристализиран меден сулфат \text{CuSO}_4 \cdot 5\text{H}_2\text{O} ч.з.а. или живак или живачен окис \text{HgO} ч.з.а.; 3.3. гранулиран цинк, ч.з.а.; 3.4. сярна киселина, ч.з.а., плътност 1,84; 3.5. сярна киселина, 0,1; 3.6. сярна киселина, 0,5 N; 3.7. индикатор метилрот – 300 mg метилрот се разтварят в 100 ml етанол, 95 – 96% (о/о); 3.8. разтвор на натриева основа, 40% (т/о); 3.9. разтвор на натриева основа, 0,1%; 3.10. разтвор на натриева основа, 0,25 N; 3.11. наситен разтвор на натриев сулфид, ч.з.а.; 3.12. разтвор на натриев тиосулфат, \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3 \cdot 5\text{H}_2\text{O}, ч.з.а., 8% (т/о); 3.13. гранулирана пемза, измита със солна киселина и накалена. 4. Апаратура: апаратура за разлагане на пробата чрез изгаряне и за дестилиране по метода на Kjeldahl (виж наблюдение 7.1). 5. Процедура: 5.1. Разлагане Претегля се 1 g от пробата с точност до mg и се пренася в колбата на апарата за изгаряне. Прибавят се 10 g калиев сулфат (3.1), подходящо количество от катализатора (3.2) (0,3 до 0,4 g от медния окис или 0,9 до 1,2 g от медния сулфат; или капка живак или 0,6 до 0,7 g живачен окис), 25 ml сярна киселина (3.4) и няколко гранули пемза (3.11). Хомогенизира се. Отначало колбата внимателно се нагрява, като се разклаща от време на време, докато масата се овъгли и престане да се образува дим; тогава се усилва нагряването, докато течността постепенно започне да кипи. Внимава се да не се прегреят стените и към тях да не прилепнат органични частици. След като разтворът се избистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор, съдържащ мед), кипенето продължава още един час, след което се оставя да изстине. 5.2. Дестилация Внимателно се добавят 250 – 350 ml вода, разбърква се, докато се разтворят напълно сулфатите; оставя се да изстине; добавят се няколко гранули цинк (3.3). В приемната колба на дестилационната апаратура се наливат точно 25 ml 0,1 N (3,5) или 0,5 N (3,6) сярна киселина в зависимост от предполагаемото количество азот (виж наблюдение 7.2) и се добавят няколко капки индикатор метилрот (3,7). Колбата се съединява с хладника на дестилационната апаратура и краят на хладника се потапя на дълбочина най-малко 1 cm в течността, която се намира в приемната колба (виж наблюдение 7.3). Чрез изпускателната фуния в колбата се наливат бавно 100 ml 40% разтвор на натриева основа (3,8). Ако е използван живак, съдържащ катализатор, се добавят също или 10 ml разтвор на натриев сулфид (3,11), или 25 ml разтвор на натриев тиосулфат (3,12). Колбата се нагрява така, че за 30 min да се дестилират около 150 ml течност. В края на дестилацията рН на разтвора се проверява с лакмусова хартия. Ако реакцията е алкална, дестилацията продължава. Прекъсва се, когато дестилатът стане неутрален според лакмусовата хартия. По време на дестилацията се наблюдава оцветяването и съдържанието на приемната колба се разклаща от време на време. Ако течността стане жълта, незабавно се добавя точно определено количество 0,1 N (3,5) или 0,5 N (3,6) сярна киселина. 5.3. Титруване Излишъкът от сярна киселина в приемната колба се титрува с 0,1 N (3,9) или 0,25 N (3,10) разтвор на натриева основа в зависимост от нормалността на използваната сярна киселина, докато цветът стане бледожълт. 5.4. Проверка на метода За да се провери дали реактивите не съдържат азот, се прави празна проба (дестилиране и титруване, като се пропускат пробите, които трябва да бъдат анализирани). За да се провери точността на метода, се провеждат анализи (разлагане, дестилиране и титруване) на 1,5 до 2,0 g ацетанилид ч.з.а. (точка на топене 114°C; % N: 10,36) в присъствие на 1 g захароза, несъдържаща азот; 1 g ацетанилид е еквивалентен на използването на 14,80 ml 0,5 N сярна киселина. 6. Пресмятане на резултатите Определя се обемът на използваната сярна киселина. Един ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост. Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,2 като абсолютна стойност – при съдържание на суров протеин, по-малко от 20%; • 1,0% като относителна стойност – при съдържание не по-малко от 20% и не по-голямо от 40%; • 0,4 като абсолютна стойност – при съдържание повече от 40%. 7. Наблюдения. 7.1. Може да бъде използвана апаратура, при която се налага прехвърляне между етапите на изгаряне и дестилация. Ако се използва такава апаратура, прехвърлянето трябва да бъде извършено без загуби. 7.2. При продукти с ниско азотно съдържание обемът на 0,1 N сярна киселина, която се поставя в приемната колба, може (ако е необходимо) да бъде намален до 10 или 15 ml и да се допълни до 25 ml с вода. 7.3. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с изпускателна фуния, натриевата основа се прибавя непосредствено преди свързването на колбата с хладника, като течността се налива бавно по стената на кондензора, така че да не се смеси с киселия разтвор. XV. Метод за определяне на влага 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определя съдържанието на влага в храните за животни. Той не обхваща анализа на млечни продукти, използвани като директни храни за животни, анализа на минерални субстанции и смеси, съставени преобладаващо от минерални вещества, анализа на животински и растителни мазнини и масла или анализа на маслодайни семена и маслодайни плодове. 2. Принцип Пробата се изсушава при точно определени условия, които варират в съответствие с характера на храните за животни. Загубата на маса се определя чрез претегляне. Необходимо е да се извърши предварително изсушаване, когато се работи с твърди храни за животни с високо съдържание на влага. 3. Апарати: 3.1. мелница от материал, който не абсорбира влага и е лесен за почистване, позволява бързо, равномерно раздробяване, без да предизвиква някакво значително затопляне, предотвратява контакт с външния въздух, доколкото е възможно, и отговаря на изискванията, посочени в 4.1.1 и 4.1.2 (примерно: чук или водно-охлаждани и микромелници/трошачки, сгъваеми конусни мелници, бавнооборотни или мелници/трошачки със зъбчати колела); 3.2. аналитична везна с точност до 0,5 mg; 3.3. сухи контейнери от некорозиращ метал или от стъкло с капаци, осигуряващи херметично затваряне; работна повърхност, позволяваща пробите за тест да бъдат разстлани на около 0,3 g/cm2; 3.4. електрически нагрявана изотермична сушилня (\pm 1^\circ\text{C}), подходящо вентилирана и осигуряваща бързо регулиране на температурата (3); За изсушаване на зърнени растения, брашно, булгур и едро смляно брашно пещта трябва да има такъв температурен капацитет, че когато е предварително поставена на 131°C, тя да се върне на тази температура за по-малко от четиридесет и пет минути, след като максималният брой проби за тест е поставен вътре, за да се суши едновременно. Вентилацията трябва да бъде такава, че когато колкото може повече проби от житни култури, които тя може да побере, са изсушени за два часа, резултатът да се различава от този, получен след четири часа сушене, с по-малко от 0,715 %. 3.5. електически нагреваема вакуум сушилня с регулиране, снабдена с маслена помпа и/или механизъм за вкарване на горещ сух въздух или изсушаващ агент (напр. калциев окис); 3.6. сушилня с плътна перфорирана метална или порцеланова плоча (чиния), съдържаща ефикасен изсушаващ агент – ексикатор. 4. Процедура Описаните операции се извършват веднага след отварянето на пакетите с пробите. Анализът се извършва най-малко два пъти. 4.1. Подготовка 4.1.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към посочените в 4.1.2 и 4.1.3. Взима се най-малко 50 g от пробата. Ако е необходимо, се разтрошават или се разделят по такъв начин, че да се избегне всякаква вариация в съдържанието на влага (виж 6). 4.1.2. Житни растения шрот и булгур Взимат се най-малко 50 g от пробата. Смила се на частици, от които най-малко 50 % минават през мрежесто сито с отвори 0,75 mm така, че да се получи не повече от 10 % остатък върху мрежесто сито с отвори с размер 1 mm. 4.1.3. Храни за животни в течна форма или във вид на капа (in liquid or paste form), храни за животни, състоящи се предимно от масла и мазнини. Взимат се около 25 g от пробата, претеглят се с точност до 10 mg, добавя се подходящо количество безводен пясък, претеглено с точност до 10 mg, и се бърка, докато се получи един хомогенен продукт. 4.2. Сушене 4.2.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към 4.2.2 и 4.2.3. Претеглят се един контейнер (3.3) с неговия капак с точност до 0,5 mg. В претегления контейнер с точност до 1 mg се претеглят около 5 g от пробата и равномерно се разстилат. Поставя се бързо контейнерът без неговия капак в пещта, предварително загрята до 103 °C. За да се предпази температурата в сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Оставя се да се суши за 4 h, смятани от времето, когато температурата в сушилнята се върне на 103 °C. Отстранява се капакът на контейнера, отстранява се от сушилнята, оставя да изстине от 30 до 45 min в ексикатора (3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Храни за животни, съставени предимно от масла и мазнини, се сушат в пещта допълнително 30 min при 130°C. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,1 % от влагата. 4.2.2. Едро смляно брашно/булгур и шрот (groats and meal) Претеглят се един контейнер (3.3) и неговият капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер се претегля с точност до 1 mg около 5 g от смляната проба и се разпростира равномерно. Контейнерът без неговия капак се поставя в пещта, предварително загрята до 130°C. За да се предпази температурата в сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Оставя се да се суши 2 h, считано от момента, когато температурата в пещта се върне до 130°C. Капакът се поставя обратно върху контейнера, последният се отстранява от пещта, оставя се да изстине от 30 до 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 g. 4.2.3. Комбинирани храни за животни, съдържащи повече от 4 % захароза и лактоза (sucrose or lactose): директни храни за животни, като плод от рожкови (locust beans), хидролизирани житни продукти, малцови семена, сушени резени от захарно цвекло, риба и разтворими захари; комбинирани храни за животни, съдържащи повече от 25 % минерални соли, вкл. вода от кристализация. Претеглят се един контейнер (3.3) с неговия капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер се претеглят с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разпростират равномерно. Контейнерът се поставя без неговия капак във вакуум сушилнята (3.5), предварително загрята до между 80°C и 85°C. За да се предпази температурата във вакуум сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Налягането се повишава до 100 Torr и се оставя да се суши 4 h при това налягане или в струя от горещ, сух въздух; или използвайки сушилен агент (около 300 g за 20 проби). В последния момент вакуумната помпа се изключва, когато е достигнато предписаното налягане. Времето за сушене се отчита от момента, когато температурата в сушилнята се върне на 80°C до 85°C. Пещта внимателно се връща обратно до атмосферно налягане. Пещта се отваря, веднага се поставя капакът на контейнера, отстранява се контейнерът от сушилнята, оставя се да изстине от 30 до 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Суши се допълнително 30 min във вакуум сушилнята при 80°C до 85°C и се претегля отново. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,71 % влага. 4.3. Предварително изсушаване 4.3.1. Храни за животни, различни от тези, включени в т. 4.3.2 Твърдите храни за животни с високо съдържание на влага, което прави трудно раздробяването им, трябва да бъдат обект на предварително изсушаване, както следва: Претеглят се 50 g от нераздробената мостра с точност до 10 mg (компресирани или агломерирани храни за животни могат да бъдат грубо разделени, ако е необходимо) в подходящ контейнер (напр. една алуминиева чиния с размери 20 × 12 cm и с 0,75 cm ръб). Оставя се да се суши в сушилня при 60°C до 70°C, докато съдържанието на влага намалее между 8 и 12 %. Отстранява се от пещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 1 h и се претегля с точност до 10 mg. Раздробява се веднага, както е посочено в т. 4.1.1, и се изсушава, както е посочено в 4.2.1 или 4.2.3 в съответствие с вида на фуража. 4.3.2. Житни растения / Cereals Зърно със съдържание на влага над 17 % трябва да бъде предмет на предварително изсушаване, както следва: претеглят се 50 g несмляно зърно с точност до 10 mg в подходящ контейнер (например една алуминиева чиния с размери 20 × 12 cm с ръб от 0,5 cm). Оставя се да се изсуши за 5 до 7 min в пещ при 130°C. Отстранява се от пещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 2 h и се претегля с точност до 10 mg. Смила се веднага, както е посочено в т. 4.1.2, и се изсушава, както е посочено в т. 4.2.2. 5. Калкулиране на резултатите Съдържанието на влага като процент на пробата се изчислява чрез използване на следните формули: 5.1. Изсушаване без предварително изсушаване: \frac{100}{E - m}, където: Е е началната маса от пробата за тест, в g; m – масата на сухата проба за тест, в g. 5.2. Сушене с предварително изсушаване \left[ \frac{(M' - m)M}{M'} + E - M \right] \frac{100}{E} = 100 \left( 1 - \frac{Mm}{EM'} \right), където: Е е началната маса на пробата за тест след предварително изсушаване, в g. M' – масата на пробата за тест след раздробяване или смилане, в g; m – масата на изсушената проба за тест, в g. 5.3. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би следвало да надвишава 0,2 % влага. 6. Наблюдение Ако се докаже, че раздробяването е необходимо и ако се види, че това намалява съдържанието на влага в продукта, резултатите от анализа на компонентите на храната за животни трябва да бъдат коригирани на базата на съдържанието на влага на пробата в нейното начално състояние. XVI. Метод за определяне на амоняк (volatile nitrogenous bases) А. МИКРОДИФУЗИЯ 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, проявяващи се като амоняк (ammonia), в храните за животните. 2. Принцип Пробата се екстрахира с вода и разтворът се избистря и филтрира. Амонякът се измества чрез микродифузия, използвайки разтвор на калиев карбонат, събран в разтвор от борна киселина, и се титрува със сярна киселина. 3. Реактиви: 3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина; 3.2. индикатор – разтварят се 33 mg от бромкресол грюн (bromocresol green) и 65 mg метил рот в 100 ml 95 % – 96 % (v/v) етанол; 3.3. разтвор на борна киселина / Boric acid solution: в градуирана колба от 1 l се разтварят 10 g борна киселина чиста за анализ в 200 ml 95 – 96 % (v/v) етанол и 700 ml вода; прибавят се 10 ml от индикатора (3.2); смесва се и ако е необходимо, се установява цветът на разтвора до леко червено чрез добавяне разтвор на натриев хидроокис / sodium hydroxide. 1 ml от този разтвор ще фиксира максимум 300 g от NH3; 3.4. разтвор на наситен калиев карбонат / Saturated potassium carbonate solution: разтварят се 10 g калиев карбонат A. R. в 100 ml вряща вода; оставя се да изстине и се филтрира; 3.5. сярна киселина 0,02 N. 4. Апарати: 4.1. миксер (въртящ се барабан) – приблизително при скорост от 35 до 40 оборота в min; 4.2. чашка на Конвей (glass or plastic Conway cells) (виж фигурата): 4.3. градуирани стъкленици - 1/100 ml. 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставят със 100 ml вода в една градуирана колба от 200 ml. Разбърква се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до нужния обем с вода, енергично се разклаща и се филтрира през един нагънат филтър / pleated filter. Използва се пипета, внася се 1 ml разтвор на борна киселина (3.3) в централната част на клетката на Конвей и 1 ml от филтрата на пробата във външната камера на чашката (crown of the cell). Покрива се частично със смазания капак. Капва се 1 ml разтвор на наситен калиев карбонат (3.4) бързо в чашката и капакът се затваря, така че чашката да е херметично затворена. Разклаща се внимателно чашката на Конуей хоризонтално, така че двата реактива да се смесят. Оставя се да действа (incubate) или за наймалко 4 h при стайна температура, или за 1 h при 40°C. Използва се градуирана колба (4.3), летливите основи се титруват в разтвор от борова киселина със сярна киселина 0,02 N (3.5). Прави се бланков тест (празен тест), като се прилага същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана. 6. Калкулиране на резултатите 1 ml от \text{H}_2\text{SO}_4 0,02 N отговаря на 0,34 mg от амоняк. Резултатите се изразяват като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не следва да надвишават: 10 %, в относителна стойност/value – при съдържание на амоняк, по-малко от 1,0%; 0,1 %, в абсолютна стойност – при съдържание на амоняк 1,0 % или повече. 7. Наблюдение Ако съдържанието на амоняк в пробата превишава 0,76 %, началният филтрат се разрежда. Б. ЧРЕЗ ДЕСТИЛАЦИЯ 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на амоняк (volatile nitrogenous bases), проявяващи се като амоняк, рибно брашно, несъдържащо практически урея. Той е приложим само при съдържание на амоняк, по-малко от 0,25 %. 2. Принцип Пробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрува. Амонякът са отделя при точката на кипене чрез добавяне на магнезиев окис и се събира в точно определено количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува остатъчно с разтвор на натриев хидроокис (sodium hydroxide). 3. Реактиви: 3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина; 3.2. магнезиев окис /Magnesium oxide ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ; 3.3. емулсия против образуването на пяна – например силикон; 3.4. сярна киселина 0,1 N; 3.5. разтвор на натриев хидроокис (Sodium hydroxide solution) 0,1 N; 3.6. 0,3 % (w/v) разтвор на метил червен в 95 % – 96 % (v/v) етанол. 4. Апаратура: 4.1. миксер (Mixer – tumbler): приблизително 35 до 40 оборота min; 4.2. дестилационен апарат от Келдалов тип (Kjeldahl type). 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставя с 100 ml вода в градуирана колба от 200 ml. Смесва се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до обема с вода, разклаща се енергично и се филтрира през нагънат филтър. Взема се едно количество от чист филтрат, подходящо за предполагаемото съдържание на летливи азотни основи (100 ml обикновено са достатъчни). Разрежда се до 200 ml и се добавят 2 g магнезиев окис (3.2) и няколко капки от емулсия против пяна (3.3). Разтворът би трябвало да е алкален към лакмусова хартия, в противен случай се добавя малко магнезиев окис (3.2). Дестилират се около 150 ml от разтвора в апарата на Kjeldahl и дестилатът се събира в една колба на Erlenmaйer (Erlenmeyer), съдържаща точно измерен обем (25 до 50 ml) от сярна киселина 0,1 N (3.4). Докато се извършва дестилацията, се избягва претоплянето на страните. Разтворът на сярната киселина се кипва за 2 min, охлажда се и излишъкът от сярна киселина се титрува обратно с разтвор на натриев хидроокис 0,1 N (3.5) в присъствието на метил рот като индикатор (methyl red indicator) (3.6). Извършва се празен тест, като се следва същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана. 6. Калкулиране на резултатите 1 ml \text{H}_2\text{SO}_4 0,1 N съответствува на 1,7 mg амоняк. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би следвало да надхвърля в относителна стойност (relative value) 10 % амоняк. XVII. Метод за определяне общото съдържание на фосфор ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на общ фосфор в храните за животни. Той е особено подходящ за анализа на нискофосфорни продукти. В определени случаи (продукти, богати на фосфор) може да бъде използван гравиметричен метод. 2. Принцип Пробата се минерализира или чрез сухо горене (при органични храни за животни), или чрез киселинно смилане (при минерални комбинирани или течни храни за животни), поставена в киселинен разтвор. Разтворът се третира с молибдованадиев (molybdovanadate) реактив. Оптическата плътност на така образувания жълт разтвор се измерва в спектрофотометър (spectra-photometer) при 430 nm. 3. Реактиви: 3.1. калциев карбонат ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ; 3.2. хидрохлорна киселина/Hydrochloric acid ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, p/d/: 1,1 (прибл. 6 N); 3.3. азотна киселина ЧИСТ 3А АНАЛИЗ, p: 1,045; 3.4. азотна киселина ЧИСТ 3А АНАЛИЗ, p: 1,38 до 1,42; 3.5. сярна киселина ЧИСТ 3А АНАЛИЗ, p: 1,84; 3.6. молибдено-ванадиев реактив: смесват се 200 ml разтвор на амониев молибден (ammonium heptamolybdate solution) (3.6.1), 200 ml разтвор на амониев молибдат (ammonium monovanadate solution) (3.6.2) и 134 ml азотна киселина (3.4) в една еднолитрова градуирана колба; обемът се допълва с вода; 3.6.1. разтвор на амониев молибдат/Ammonium heptamolybdate solution: в топла вода се разтварят 100 g амониев амолибдат – чист за анализ (\text{NH}_4) 6\text{Mo}_7\text{O}_{24}\cdot 4\text{H}_2\text{O}. добавят се 10 ml амоняк (p: 0,91) и се допълва до 11 с вода; 3.6.2. амониев монованадан – разтвор/Ammonium monovanadate solution: 2,735 g амониев монованадат (ammonium monovanadate) ЧИСТ 3А АНАЛИЗ \text{NH}_4\text{VO}_3 се разтварят в 400 ml гореща вода. Разбърква се постоянно, бавно се добавят 20 ml разредена азотна киселина (7 ml от \text{HNO}_3 (3.4) + 13 ml на \text{H}_2\text{O} и се допълва до 11 с вода. 3.7. Стандартен разтвор на 1 mg фосфор на ml: Разтварят се 4,387 g от калиев дихидрогенен фосфат (potassium dihydrogen phosphate) чист за анализ \text{K}_2\text{PO}_4 във вода. Допълва се до 11 с вода. 4. Апаратура: 4.1. силициеви (кварцови) или порцеланови съдове за пепел/Silica or porcelain ashing crucibles; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат, установен на 550 °C (Electric muffle-furnace with thermostat); 4.3. 250 ml Kjeldahl колба; 4.4. градуирани колби и прецизни пипети; 4.5. спектрофотометър / Spectrophotometer; 4.6. епруветки от около 16 mm в диаметър, със запушалки, градуирани до диаметър от 14,5 mm; с обем : 25 до 30 ml. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора В съответствие с естеството на пробата се приготвя разтвор, както е посочено в т.5.1.1 или т. 5.1.2. 5.1.1. Обикновена процедура 1g или повече от пробата се претеглят с точност до 1 mg. Пробата се поставя за теста в една Киедалова (Kjeldahl) колба, добавят се 20 ml сярна киселина acid (3.5), разклаща се, за да се намокри веществото изцяло с киселина и за да се предпази от залепване по стените на колбата, нагрява се и се оставя при точка на кипене за 10 min. Оставя се да изстине леко, добавят се 2 ml азотна киселина (3.4), нагрява се умерено, оставя се да изстине леко, добавя се още малко азотна киселина (3.4) и се връща до точката на кипене. Тази процедура се повтаря, докато се получи безцветен разтвор. Охлажда се, добавя се малко вода, течността се прелива в една 500 ml градуирана колба, изплаквайки Kjeldahl колбата с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема с вода, хомогенизира се и се филтрира. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без съдържание на калциев и магнезиев дихидрогенен фосфат /magnesium dihydrogen phosphates. Претеглят се около 2,5 g от пробата с точност до 1 mg в шахтна пещ. Пробата за теста се бърка, докато напълно се смеси с 1 g калциев карбонат (3.1). Изпепелява се в пещта при 550 °C \pm 5 °C, докато бъде получена бяла или сива пепел (малко дървени въглища не са от значение). Пепелта се прехвърля в една 250 ml мензура (Beaker). Добавят се 20 ml вода и хидрохлорна киселина /hydrochloric acid/ (3.2), докато бурното кипене престане. Прибавят се допълнително 10 ml хидрохлорна киселина (3.2). Мензурата се поставя на пясъчна баня и се изпарява до сухо, за да се направи силициевият двуокис (кварцът) неразтворим. Утайката се разтваря отново в 10 ml азотна киселина (3.3) и се кипва на пясъчната баня за 5 минути без изпаряване до изсушаване. Течността се пресипва в една 500 ml градуирана колба, изплаквайки мензурата няколко пъти с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема с вода, хомогенизира се и се филтрира. 5.2. Изменение в цвета и измерване на оптическата плътност Кратна част от получения филтрат се разрежда, както е посочено в т. 5.1.1 и т. 5.1.2, за да се получи фосфорна концентрация от не повече от 40 mg/ml. Поставят се 10 ml от този разтвор в една епруветка (4.6) и се добавят 10 ml от молибдено-ванадатиев реактив (molybdovanadate) (3.6). Хомогенизира се и се оставя за най-малко 10 min при 20 °C. Измерва се оптическата плътност в спектрофотометър при 430 nm срещу разтвор, получен чрез добавянето на 10 ml от молибдено-ванадатиевия реактив (3.6) към 10 ml вода. 5.3. Крива на калибриране От стандартния разтвор (3.7) се приготвят разтвори, съдържащи съответно 5,10, 20, 30 и 40 mg фосфор на ml. Вземат се 10 ml от всеки от тези разтвори и се добавя към тях 10 ml от молибдено-ванадатиев реактив (3.6). Хомогенизира се и се оставя да стои за най-малко 10 min при 20 °C. Оптическата плътност се измерва, както е посочено в 5.2. Кривата на калибриране се проследява чрез нанасяне на оптическите плътности/гъстоти срещу съответстващите количества фосфор. За концентрации между 0 и 40 mg/ml кривата ще бъде линейна (linear). 6. Калкулиране на резултатите Количеството на фосфора в пробата за тест се определя чрез използване кривата на калибриране. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би трябвало да надвишава 3 % в относителна стойност – при фосфорно съдържание, по-малко от 5 %; 0,15 %, в абсолютна стойност – при фосфорно съдържание от 5 % или повече. XVIII. Метод за определяне на сурови масла и мазнини 1. Задача и обхват Това е метод за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в животинските храни. Той не обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла. Използването на описаните процедури, зависи от характера и състава на животинските храни и повода за извършване на анализа. 1.1. Процедура А – сурови масла и мазнини, които могат да се извлекат пряко – този метод е приложим за хранителни материали от растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б. 1.2. Процедура Б – общо съдържание на сурови масла и мазнини – този метод е приложим за хранителни материали от животински произход и за всички комбинирани храни. Използва се за всички материали, от които маслата и мазнините не могат да бъдат напълно извлечени без предварителна хидролиза (напр. глутени, дрожди, картофени белтъчини и продукти, предмет на процеси, като екструдиране, настъргване на люспи и нагряване). 1.3. Интерпретиране на резултатите – във всички случаи, при които по-висок резултат се получава при използване на процедура Б, отколкото се получава при процедура А, полученият по процедура Б резултат се приема като вярна стойност. 2. Принцип 2.1. Процедура А – пробата се извлича с петролев етер. Разтворителят се дестилира, а остатъкът се изсушава и измерва. 2.2. Процедура Б – пробата се обработва термично със солна киселина. Сместа се охлажда и филтрира. След като бъде промит и изсушен, остатъкът се подлага на определяне съгласно процедура А. 3. Реактиви 3.1. петролев етер, диапазон на кипене: от 40 до 60 °C. Индексът на брома трябва да бъде помалък от 1, а остатъкът след изпарението – помалък от 2 mg/100 ml; 3.2. натриев сулфат, безводен; 3.3. солна киселина, 3 N; 3.4. филтрираща добавка, например инфузорна пръст, Hyflo-supercel. 3.5. вълероден тетрахлорид A.R. 4. Апаратура 4.1. Екстрактор. Ако апаратът има сифон (Сокслетов апарат), дебитът на нагряването с обратен хладник трябва да бъде такъв, че да се получават най-малко десет цикъла в час. Ако апаратът е без сифон, дебитът на обратния хладник трябва да бъде около 10 ml в min. 4.2. Екстракционни патрони без разтворими в петролев етер вещества и чиято поръзност съответства на изискванията на т. 4.1. 4.3. Сушилня или вакуумсушилня, настроена при 75 °C ±3 °C, или въздушна пещ, настроена при 100 °C ±3 °C. 5. Процедура 5.1. Процедура А (виж т. 8.1) Претеглят се 5 g от пробата с точност 1 mg, прехвърлят се в екстракционен патрон (4.2) и се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактор (4.1) и в продължение на 6 h се извлича с петролен етер (3.1). Екстрактът се събира в суха претеглена колба, в която има няколко късчета пемза1. Чрез дестилация се отстранява разтворителят. Остатъкът се изсушава, като в продължение на 1,5 h колбата се поставя в сушилнята (4.3). Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 min, за да се осигури теглото на маслата и мазнините да остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg). 5.2. Процедура Б Претеглят се 2,5 g от пробата с точност 1 mg (вж. т. 7.2), поставят се в бехерова чаша 400 ml или ерленмайерова колба 300 ml и се добавят 100 ml солна киселина (3.3) и няколко късчета пемза. Бехеровата чаша се покрива с наблюдателно стъкло или към коничната колба се свързва обратен хладник. Сместа се нагрява до слабо кипене на слаб пламък или на котлон и така се държи в течение на 1 h. Следи се продуктът да не залепне по стените на контейнера. Охлажда се и се добавя достатъчно количество от филтрационната добавка (3.4), за да се предотврати всякаква загуба на мазнини при филтрирането. Филтрира се през навлажнена обезмаслена двойно филтрираща хартия. Остатъкът се промива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Филтратът се проверява за съдържание на масла и мазнини. Тяхното наличие показва, че пробата трябва да се извлече с петролен етер, като се използва процедура А, преди хидролизата. Двойната филтрираща хартия, съдържаща сухия остатък, се поставя върху наблюдателно стъкло и се суши един час и половина във въздушната пещ (4.3) 100 °C ±3 °C. Двойната филтрираща хартия се поставя в екстракционен патрон (4.2), който се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактора (4.1) и се продължава, както е посочено във втори и трети абзац на 5.1. 6. Изразяване на резултатите Теглото на остатъка се изразява като процент от пробата. Повторяемост 1 Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания. Разликата между две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не трябва да превишава: – 2% в абсолютна стойност – за съдържание на сурови масла и мазнини, по-ниско от 5 %; – 4 % в абсолютна стойност спрямо най-високия резултат – за съдържание от 5 до 10 %; – 0,4 % в абсолютна стойност – за съдържание над 10 %. 7. Забележки 7.1. При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които е трудно да се строшат или са неподходящи за изтегляне на хомогенна редуцирана проба за изпитване, се процедира, както следва: Претеглят се 20 g от пробата с точност 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3.2). С петролев етер (3.1) се извлича, както е посочено в т. 5.1. Полученият екстракт се долива до 500 ml с въглероден тетрахлорид (3.5) и се хомогенизира. Вземат се 50 ml от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа парчета пемза1. Разтворителят се отстранява чрез дестилиране, изсушава се и се продължава, както е посочено в последния абзац на т. 5.1. Разтворителят се отстранява от остатъка от екстракцията, останал в патрона, остатъкът се строшава до едрина на частиците 1 mm, връща се в екстракционния патрон (без да се добавя натриев сулфат) и се продължава, както е посочено в 1.2 и 1.3. Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула: (10 a + b).5, където: a е масата на остатъка след първата екстракция (аликватна част на екстракта), в g; b – масата на остатъка след втората екстракция, в g. 7.2. При продукти с ниско съдържание на масла и мазнини пробата за изпитване може да бъде увеличена до 5 g. 7.3. Храните за домашни любимци, които имат високо съдържание на вода, може да е нужно да бъдат смесени с безводен натриев сулфат преди хидролизата и екстракцията, както при процедура Б. 7.4. В т. 5.2 може да е по-ефективно да се използва гореща вода вместо студена вода за измиване на остатъка след филтрирането. 7.5. Времето за сушене 1,5 h може да е нужно да се удължи при някои животински храни. Трябва да се избягва излишното сушене, тъй като може да доведе до лоши резултати. Може да се използва също така микровълнова печка. 7.6. Предварителната екстракция при процедура А преди хидролизата и повторната екстракция при процедура Б се препоръчват, ако съдържанието на сурови масла / мазнини е по-голямо от 15 %. В известна степен това зависи от характера на животинската храна и характера на маслата/мазнините в животинската храна. 1 Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания. XIX. Метод за определяне на аминокиселини 1. Цел и област на приложение Настоящият метод е за определяне на свободните (синтетични и естествени) аминокиселини и общите (пептидно свързани и свободни) аминокиселини в животински храни, като се използва анализатор на аминокиселини. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспартитова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолеуцин, леуцин, фенилаланин, пролин, серин, тирозин и валин. Методът не разграничава солите на аминокиселините и не може да диференцира D и L формите на аминокиселините. Той не е валиден за определяне на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселини. 2. Принцип 2.1. Свободни аминокиселини Свободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените заедно с тях азотни макромолекули се утаяват със сулфосалицилова киселина и се отстраняват чрез филтриране. Филтрираният разтвор се коригира на pH 2,20. Аминокиселините се отделят чрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакция с нинхидрин и фотометрична детекция при 570 nm. 2.2. Общо съдържание на аминокиселини Избраният метод зависи от изследваните аминокиселини. Цистеинът и метионинът се окисляват до цистеинова киселина и метионин сулфон съответно преди хидролиза. Тирозинът се определя в хидролизати на неокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в абзац 1, могат да бъдат определени в окислена проба или в неокислена проба. Окисляването се извършва при 0°C със смес на пероксимравчена киселина и фенол. Излишъкът от окислителния реактив се разлага с натриев сулфид. Окислената или неокислена проба се хидролизира със солна киселина (c = 6 mol/l) в продължение на 23 часа. Хидролизатът се коригира до pH 2,20. Аминокиселините се отделят чрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакция с нинхидрин, като се използва фотометрична детекция при 570nm (440 nm за пролина). 3. Реактиви Използва се бидестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < 10 \muS). 3.1. водороден прекис, 30 % (m/m); 3.2. мравчена киселина, 98 – 100 % (m/m); 3.3. фенол; 3.4. натриев дисулфид; 3.5. натриев хидроокис; 3.6. дихидрат на 5-сулфосалицилова киселина; 3.7. солна киселина, плътност 1,18 g/ml; 3.8. 3-натриев цитратен дихидрат; 3.9. 2,2'-тиодиетанол (тиодигликол); 3.10. натриев хлорид; 3.11. нинхидрин; 3.12. петролеев етер, обхват на кипене 40 – 60°C; 3.13. норлеуцин или други съединения, които могат да се използват като вътрешни еталони; 3.14. газообразен азот (< 10 ppm кислород); 3.15. 1-октанол; 3.16. аминокиселини; 3.16.1. Еталонни субстанции. Чисти съединения, несъдържащи вода от кристализация. Изсушава се под вакуум над P2O5 или H2SO4 една седмица преди употреба; 3.16.2. Цистеинова киселина; 3.16.3. метионин сулфон. 3.17. Разтвор на натриев хидрооксид, c = 7,5 mol/l: Разтварят се 300 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l. 3.18. Разтвор на натриев хидрооксид, c = 1 mol/l: Разтварят се 40 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l. 3.19. Разтвор на мравчена киселина-фенол: Смесват се 889 g мравчена киселина (3.2) с 111 g вода и се добавят 4,73 g фенол (3.3). 3.20. Хидролизна смес, c = 6 mol HCl / 1, съдържаща 1 g фенол/l: Добавя се 1 g фенол (3.3) към 492 ml HCl (3.7) и се допълва до 1 l с вода. 3.21. Екстракционна смес с 0,1 mol HCl / 1, съдържаща 2% тиодигликол: Вземат се 8,2 mg HCl (3.7), разреждат се с приблизително 900 ml вода, добавят се 20 ml тиодигликол (3.9) и се долива до 11 l с вода (не се смесват 3.7 и 3.9 пряко). 3.22. 5-сулфосалицилова киселина, c = 6%: Разтварят се 60 g 5-сулфосалицилова киселина (3.6) във вода и се долива до 1 l с вода. 3.23. Окислителна смес (пероксимравчена киселина-фенол): Смесват се 0,5 ml водороден прекис (3.1) с 4,5 ml разтвор на мравчена киселина-фенол (3.19) в малка бехерова чаша. Инкубира се (термостатира се) при 20 – 30°C в продължение на 1 h, за да се образува пероксимравчена киселина, след това се охлажда в ледена баня (15 min) преди добавянето към пробата. Внимание! Да се избягва контакт с кожата и да се носи защитно облекло. 3.24. Цитратен буфер, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Разтварят се 19,61 g натриев цитрат (3.8), 5 ml тиодигликол (3.9), 1 g фенол (3.3) и 16,50 ml HCl (3.7) в приблизително 800 ml вода. Коригира се pH на 2,20. Долива се до 1 l с вода. 3.25. Отмиващи буфери, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9). 3.26. Нинхидрин реагент, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9). 3.27. Еталонни разтвори на аминокиселини. Тези разтвори се съхраняват при температури под 5°C. 3.27.1. Изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.16.1) – c = 2,5 μmol/ml за всяка в солна киселина. 3.27.2. Изходен еталонен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон – c = 1,25 μmol/ml. Разтварят се 0,2115 g цистеинова киселина (3.16.2) и 0,2265 g метионин сулфон (3.16.3) в цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба 1 l и се допълва до отметката с цитратен буфер. Съхранява се под 5°C не по-дълго от 12 месеца. Този разтвор не се използва, ако стандартният изходен разтвор (3.27.1) съдържа цистеинова киселина и метионин сулфон. 3.27.3. Изходен еталонен разтвор на вътрешен еталон, например норлеуцин – c = 20 μmol/ml. Разтварят се 0,6560 g норлеуцин (3.13) в цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба и се доливат до 250 ml с цитратен буфер. Съхранява се под 5°C не по-дълго от 6 месеца. 3.27.4. Калибриращ разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати – c = 5 nmol/50 μl на цистеинова киселина и метионин сулфон и c = 10 nmol/50 μl на другите аминокиселини. Разтварят се 2,2 g натриев хлорид (3.10) в бехерова чаша 100 ml с 30 ml буферен цитратен разтвор (3.24). Добавят се 4,00 ml изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.27.1), 4,00 ml изходен еталонен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон (3.27.2) и ако се използва, 0,50 ml изходен еталонен разтвор с вътрешен стандарт (3.27.3). Коригира се pH до 2,20 с натриев хидрооксид (3.18). Количествено се прехвърля в мерителна обемна колба 50 ml и се долива до отметката с цитратен буфер (3.24) и се смесва. Съхранява се при температура под 5°C не по-дълго от 3 месеца. Виж също наблюдения 9.1. 3.27.5. Калибриран разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати, приготвени съгласно 5.3.3.1 и за използване с екстракти (5.2). Калибрираният разтвор се приготвя съгласно 3.27.4, като се пропуска натриевият хлорид. Съхранява се при температура под 5°C не по-дълго от 3 месеца. 4. Апаратура 4.1. Колба с кръгло дъно 100 или 250 ml с обратен хладник. 4.2. Флакон от боросиликатно стъкло 100 ml с винтова тапа с гумен/тефлонов уплътнител (напр. Duran, Schott) за използване в пещ. 4.3. Пещ с изкуствена вентилация и регулатор на температурата с точност над ± 2°C. 4.4. pH-метър (с градуиране на три знака след десетичната запетая). 4.5. Мембранен филтър (диаметър на отворите 0,2 μm). 4.6. Центрофуга. 4.7. Ротационен вакуумен изпарител. 4.8. Механичен вибратор или магнитна бъркалка. 4.9. Анализатор на аминокиселини или HPLC оборудване за HPLC с йоннообменна колона, уред за нинхидрин, дериватизация след колоната и фотометричен детектор. Колоната се пълни със сулфонови полистиролови смоли, които могат да разделят аминокиселини една от друга, и от други материали, реагиращи положително на нинхидрина. Потокът в линиите на буферния разтвор и нинхидрина се осигурява от помпи със стабилност на дебита приблизително 0,5 % в периода, който обхваща еталонното калибриране и анализа на пробата. При някои анализатори на аминокиселини могат да се използват хидролизни методи, при които хидролизатът е с концентрация на натрий \text{C} = 0,8 \text{ mol/l} и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Други не дават задоволителна сепарация на някои аминокиселини, ако хидролизатът съдържа в излишък мравчена киселина и/или високи концентрации на натриеви йони. В този случай обемът на киселината се намалява чрез изпаряване до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригирането на pH. Изпаряването трябва да се извърши под вакуум при максимум 40^\circ\text{C}. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се смила, за да се постигне гранулометрия 0,5 mm. Пробите с голямо съдържание на влага трябва да се изсушат с въздух при температура, която не превишава 50^\circ\text{C}, или чрез лиофилизация преди смилане. Пробите с високо съдържание на мазнини трябва да бъдат извлечени с петролев етер (3.12) преди стриването. 5.2. Определяне на свободните аминокиселини в животински храни и предварително приготвени смеси Претеглят се с точност до 0,2 mg подходящо количество (1 – 5 g) от приготвената проба (5.1) в ерленмайерова колба и се прибавят 100 ml от извлечената смес (3.21). Сместа се разтръсква в продължение на 60 min с помощта на механичен вибратор или магнитна бъркалка (4.8). Седиментът се оставя да се утаява и се пипетира 10 ml от плаващия отгоре слой на разтвора в бехерова чаша от 100 ml. Добавят се 5 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (3.22) с бъркане, като се продължава бъркането с помощта на магнитна бъркалка в продължение на 5 min. Филтрира се и се центрофугира плаващият отгоре слой, за да се отстранят всички твърди фази. Поставят се 10 ml от получения разтвор в бехерова чаша 100 ml и pH се коригира на 2,20, като се използва разтвор на натриев хидроксид (3.18), прехвърля се в мерителна обемна колба с подходящ обем, като се използва цитратен буфер (3.24) и се долива до отметката с буферен разтвор (3.24). Ако се използва вътрешен еталон, се добавят 1 ml вътрешен еталон (2.27.3) за всеки 100 ml краен разтвор и се долива до отметката с буферен разтвор (3.24). Преминава се към етапа на хроматографията съгласно 5.4. Ако екстрактите не се изпитват същия ден, те трябва да се съхраняват при температури под 5^\circ\text{C}. 5.3. Определяне на общото съдържание на аминокиселини 5.3.1. Окисляване Претеглят се с точност 0,2 mg от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1) във: – облодънна колба 100 ml (4.1) за хидролиза на открито (5.3.23), или – облодънна колба 250 ml (4.1), ако се изисква ниска концентрация на натрий (5.3.3.1), или – флакон 100 ml, снабден с винтова капачка (4.2) (за затворена хидролиза 5.3.2.4). Претеглената част от пробата трябва да има съдържание на натрий около 10 mg и съдържание на влага, което не превишава 100 mg. Колбата / флаконът се поставя в ледена водна вана и се охлажда до 0^\circ\text{C}, добавят се 5 ml окисляваща смес (3.23) и се смесват, като се използва стъклена шпатула с извит накрайник. Колбата / флаконът се запечатват с шпатулата вътре с непропускащ въздух тънък слой, поставя се ледената водна вана, в която се намира запечатаният контейнер, в хладилник при 0^\circ\text{C} и се оставя в продължение на 16 h. След 16 h се маха от хладилника и излишният окисляващ реагент се разлага с добавяне на 0,84 g натриев дисулфит (3.4). Преминава се към 5.3.2.1. 5.3.2. Хидролиза 5.3.2.1. Хидролиза на окислени проби Към окислените проби, приготвени съгласно 5.3.1, се прибавят 25 ml хидролизна смес (3.20), като внимателно се измиват всички утайки на пробата, прилепнали по стените на съда и шпатулата. В зависимост от процедурата на хидролизата, която се използва, се преминава към 5.3.2.3 или 5.3.2.4 съответно. 5.3.2.3. Хидролиза на неокислена проба В облодънна колба се претеглят 100 ml или 250 ml (4.1) или флакон 100 ml, снабден с винтова капачка (4.2), с точност 0,2 mg, от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1). Частта на претеглената проба трябва да съдържа натрий около 10 mg. Внимателно се добавят 25 ml хидролизна смес (3.20) и се смесва с пробата. По-нататък се продължава съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4. 5.3.2.3. Открита хидролиза Добавят се 3 стъклени перли към сместа в колбата (приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2) и се вари при непрекъснато кипене с нагряване с обратен хладник в продължение на 23 h. След завършване на хидролизата кондензаторът се отмива с 5 ml цитратен буфер (3.24). Колбата се откачва и се охлажда в ледена вана. Продължава се съгласно 5.3.3. 5.3.2.4. Закрита хидролиза Флаконът, съдържащ сместа, приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2 в пещ (4.3), се поставя при 110 °C. По време на първия час, за да се предотврати повишаването на налягането (поради отделяне на газообразни субстанции) и да се избегне експлозия, се поставя винтовата капачка над върха на съда. Съдът не се затваря с капачката. След един час съдът се запушва с капачката и се оставя в пещта (4.3) в продължение на 23 h. След приключване на хидролизата флаконът се маха от пещта, внимателно се отвива капачката на флакона, който се поставя в ледена водна вана. Оставя се да се охлади. В зависимост от процедурата за коригиране на pH (5.3.3) количествено съдържанието на флакона се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml или облодънна колба от 250 ml, като се използва цитратен буфер (5.24). Продължава се съгласно 5.3.3. 5.3.3. Коригиране на pH В зависимост от натриевия толеранс на анализатора на аминокиселини (4.9) продължава се съгласно 5.3.3.1 или 5.3.3.2, за да се коригира pH. 5.3.3.1. За хроматографски системи (4.9), изискващи ниска концентрация на натрий: Препоръчително е да се използва вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3), когато се използват анализатори на аминокиселини, изискващи ниско съдържание на натрий (когато трябва да се намали обемът на киселината). В този случай се прибавят 2 ml вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3) към хидролизата преди изпаряването. Прибавят се 2 капки 1-октанол (3.15) към хидролизата, получен съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4. Като се използва ротационен изпарител (4.7), намалява се обемът до 5 – 10 ml под вакуум при 40 °C. Ако случайно обемът спадне под 5 ml, хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът да се започне отново. Коригира се pH на 2,20 с разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4. 5.3.3.2. За всички други анализатори на аминокиселини (4.9) Хидролизатите се вземат, получени съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4, и се неутрализират частично, като внимателно се добавят при непрекъснато разбъркване на 17 ml разтвор на натриев хидроокис (3.17), като се осигурява температурата да се поддържа под 40 °C. pH се коригира на 2,20 при стайна температура, като се използва разтвор на натриев хидроокис (3.17) и накрая разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4. 5.3.4. Разтвор на пробата за хроматография Количествено се прехвърля хидролизатът с коригирана pH (5.3.3.1 или 5.3.3.2) с цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба 200 ml и се долива до отметката с буфера (3.24). Ако вътрешният еталон още не е бил използван, се прибавят 2 ml от вътрешния еталон (3.27.3) и се долива до отметката цитратен буфер (3.24). Разбърква се старателно. Преминава се към етап хроматография (5.4). Ако разтворите на пробите не се изследват същия ден, те се съхраняват при температура под 5 °C. 5.4. Хроматография Преди хроматографията екстрактът (5.2) или хидролизата (5.3.4) се привежда до стайна температура. Сместа се разбърква и подходяща част от нея се филтрира през мембранен филтър 0,2 µm (4.5). Полученият бистър разтвор се подлага на йоннообменна хроматография, като се използва анализатор на аминокиселини (4.9). Инжектирането може да се извърши ръчно или автоматично. Важно е едно и също количество разтвор (\pm 0,5 \%) да се добавя в колоната за анализ на еталоните и пробите, освен когато се използва вътрешен еталон, и когато отношенията натрий / аминокиселина в разтворите на еталоните и пробите са практически подобни. По принцип честотата на калибриране зависи от стабилността на нинхидриновия реактив и системата за анализ. Еталонът или пробата се разреждат с цитратен буфер (3.24), за да се получи пикова повърхност на еталона от 30 – 200 % от пиковата площ на пробата аминокиселина. Хроматографията на аминокиселините варира в малки граници според вида на използвания анализатор на използваната смола. Избраната система трябва да може да разделя аминокиселините една от друга и от веществата, реагиращи положително на нинхидрина. В обхвата на работа хроматографската система трябва да даде линейна реакция на промените в количествата аминокиселини, прибавени в колоната. По време на хроматографията, когато се анализира еквимоларен разтвор (на аминокиселините, които се определят), се прилагат съотношения между основата и върха на пиковете, описани по-долу. Този еквимоларен разтвор трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното съдържание на всяка аминокиселина, което може да бъде точно измерено с анализатора на аминокиселини (4.9). При отделянето на треонин-серин съотношение между основата и върха на пиковете на двете застъпващи се аминокиселини на хроматограмата не трябва да превишава 2:10 (ако се определят само цистеин, метионин, треонин и лизин, недостатъчната сепарация на съседни пикове ще има неблагоприятен ефект върху определянето). За всички останали аминокиселини сепарацията трябва да бъде по-добра от 1:10. Системата трябва да осигурява отделянето на лизина от „структурите на лизина“ и на орнитина. 6. Изчисляване на резултатите Площта на пиковете на пробата и еталона се измерва за всяка отделна аминокиселина и се изчислява количеството в g аминокиселина на kg проба. A.E.MW.F \text{-----} = g B.W.1000 аминокиселина на kg мостра. Ако се използва вътрешен еталон, се умножава с D/C. А е пиковата площ, хидролизат или екстракт; В – пиковата площ, калибриращ еталонен разтвор; С – пиковата площ, вътрешен еталон хидролизат или екстракт; D – пиковата площ, вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор; MW – молекулното тегло на определяната аминокиселина; E – концентрацията на еталона в \mu\text{mol/ml}; W - теглото на пробата g (коригирано до оригиналното тегло, ако е сушено или са отстранени мазнините); F e ml общото съдържание на хидролизат (5.3.4) или ml изчислен общ обем на разтваряне на екстракта (6.1). Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в хидролизатите на окислената проба, но се изчисляват като цистин (\text{C}_6\text{H}_{12}\text{N}_2\text{O}_4\text{S}_2 молекулно тегло 240,30 чрез използване молекулно тегло 120,15 (= 0,5 \times 240,30)). Метионинът се определя като метионин сулфон в хидролизати на окислени проби, но се изчислява като метионин, като се използва молекулното тегло на метионина 149,21. Добавеният свободен метионин се определя след извличането като метионин, като за изчислението се използва същото молекулно тегло. 6.3. Общият разтворен обем екстракти (F) за определянето на свободни аминокиселини (5.2) се изчислява, както следва: (10 \text{ ml} + 5 \text{ ml}) \quad \text{V ml} F = 100 \text{ ml} \cdot \frac{10 \text{ ml}}{10 \text{ ml}} + \frac{10 \text{ ml}}{10 \text{ ml}}, където V е обемът на крайния екстракт. 7. Оценка на метода Методът е тестван чрез сравняване на резултатите на международно ниво през 1990 г., като са използвани четири различни животински храни (смесена храна за прасета, компаунд за бройлери, белтъчен концентрат, предварително приготвени смеси). Резултатите, след елиминиране на стойностите, рязко отличаващи се от нормалните, на средноаритметичното и стандартното отклонение са дадени в таблицата: Средни аритметични стойности в g/kg Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Компаунд за бройлери 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Белтъчен концентрат 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Предварително приготвена смеска 59,42 n = 16 - 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 7.1. Повторяемост Повторяемостта, изразена като „вътрешно лабораторно стандартно отклонение“ на посоченото сравнение между различни лаборатории, е дадена в следните таблици: Вътрешно лабораторно стандартно отклонение (S_t) в g/kg Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Компаунд за бройлери 0,20 n = 16 0,14 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Белтъчен концентрат 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Предварително приготвена смеска 1,30 n = 16 - 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = брой участващи лаборатории. Коефициент на вариация (%) за вътрешно лабораторно стандартно отклонение (S_t) Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Компаунд за бройлери 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Белтъчен концентрат 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Предварително приготвена смеска 2,2 n = 16 - 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 7.2. Възпроизводимост Резултатите за стандартните отклонения между лаборатории за посоченото сравнение са дадени в таблицата: Стандартно отклонение между лабораториите (S_t) в g/kg Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Компаунд за бройлери 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Белтъчен концентрат 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Предварително приготвена смеска 2,49 n = 16 - 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = брой участващи лаборатории. Коефициент на вариация (%) за стандартно отклонение между лабораториите (S_t) Референтен материал Аминокиселина Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Компаунд за бройлери 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Белтъчен концентрат 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Предварително приготвена смеска 4,3 n = 16 - 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 8. Използване на референтните материали Правилното прилагане на метода се проверява чрез извършване на повтарящи измервания на сертифицирани референтни материали, когато има такива на разположение. Препоръчва се калибриране със сертифицирани калибрирани разтвори на аминокиселини. 9. Забележки 9.1. Поради различия между анализаторите на аминокиселини крайните концентрации на калибрираните разтвори на еталонни аминокиселини (вж. 3.27.4 и 3.27.5) и на хидролизатите (вж. 5.3.4) трябва да се вземат като насока. Обхватът на линейна реакция на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини. Еталонният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да даде пикова площ в средата на обхвата. 9.2. Когато за анализ на хидролизатите се използва висококачествено течно хроматографско оборудване, експерименталните условия трябва да се оптимизират в съответствие с препоръките на производителя. 9.3. При прилагането на метода за животински храни, които съдържат повече от 1% хлорид (концентрат, минерални храни, допълнителни храни), може да се случи подценяване на метионина и трябва да се извърши специална обработка. XX. Определяне на олахиндокс (2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил)-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид) 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на олахиндокс в животински храни. Долната граница на определяне е 5 mg/kg. 2. Принцип Пробата се извлича със смес вода-метанол. Съдържанието на олахиндокс се определя с висококачествен течен хроматограф обратна фаза (HPLC), като се използва УВ детектор. 3. Реактиви: 1. метанол; 2. метанол с качество HPLC; 3. вода с качество HPLC; 4. мобилна фаза за HPLC; смес вода (3.3) – метанол (3.2), 900 + 100 (V + V). 3.5. Еталонна субстанция: чист олахиндокс (2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил)-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид), E 851; 3.5.1. изходен еталонен разтвор на олахиндокс, 250 µg/ml. Претеглят се 50 mg олахиндокс (3.5) с точност 0,1 mg в мерителна обемна колба 200 ml и се прибавят около 190 ml вода. След това колбата се поставя за 20 min в ултразвукова вана (4.1). След ултразвуковата обработка разтворът се довежда до стайна температура, съдържанието се допълва до отметката с вода и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Всеки месец разтворите се заменят със свежи. 3.5.2. Междинен еталонен разтвор на олахиндокс, 25 µg/ml 10 ml от изходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в мерителна обемна колба 100 ml, допълват се до отметката с мобилна фаза (3.4) и се разбъркват. Колбата се обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Този разтвор се приготвя всеки ден. 3.5.3. Калибриращи разтвори: В няколко градуирани колби 50 ml се прехвърлят 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 ml междинен еталонен разтвор (3.5.2). Допълват се до отметката с мобилна фаза (3.4) и се размесват. Колбите се обвиват с алуминиево фолио. Тези разтвори отговарят съответно на 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 µg олахиндокс на ml. Разтворите трябва да се приготвят всеки ден. 4. Апаратура: 4.1. ултразвукова вана; 4.2. механична бъркалка; 4.3. оборудване HPLC с УВ детектор с променлива дължина на вълната или диоден детектор; 4.3.1. хроматографска колона 250 mm × 4 mm C18, частици 10 µm или еквивалентна; 4.4. мембранен филтър 0,45 µm. 5. Процедура Забележка. Олахиндоксът е чувствителен към светлината. Всички операции се извършват при разсеяна светлина или се използват тъмнокафяви стъкленици. 5.1. Общи положения 5.1.1. Трябва да се анализира празна проба храна, за да се провери отсъствието на олахиндокс и на субстанции, които оказват влияние. 5.1.2. Извършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било добавено количество олахиндокс, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 50 mg/kg, 10 ml от изходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в ерлен-майерова колба от 250 ml и разтворът се концентрира чрез изпаряване до около 0,5 ml. Прибавят се 50 g от празната проба храна, разбърква се добре и оставя за 10 min, като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2). Забележка. За целите на този метод празната проба храна трябва да бъде подобна на тази на пробата и в нея не трябва да се открива олахиндокс. 5.2. Екстракция Сточност до 0,01 g се претеглят около 50 g от пробата. Прехвърлят се в ерленмайерова колба от 1000 ml, прибавят се 100 ml метанол (3.1) и колбата се поставя за 5 min в ултразвукова вана (4.1). Прибавят се 410 ml вода и се оставя да престои в ултразвуковата вана още 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с бъркалката в продължение на 30 min и се филтрира през нагънат филтър. 10 ml от филтрата се прехвърлят в мерителна обемна колба от 20 ml, допълва се с вода до отметката и се разбърква. Аликвотната част се филтрира през мембранен филтър (4.4) (вж. т. 9 наблюдение). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3). 5.3. Определяне с HPLC 5.3.1. Параметри: Аналитична колона (4.3.1) Мобилна фаза (3.4) смес вода (3.3) – метанол (3.2), 900 + 100 (V+V) Дебит 1,5 – 2 ml/min Дължина на вълна на откриване 380 nm Инжекционен обем 20 µl – 100 µl Проверява се стабилността на хроматографската система, като се инжектира няколко пъти калибриращият разтвор (3.5.3), съдържащ 2,5 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне. 5.3.2. Калибрираща графика Инжектира се няколко пъти калибриращ разтвор (3.5.3) и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете за всяка концентрация. Начертава се калибриращата графика, като се използват средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответните концентрации в µg/ml за абсциси. 5.3.3. Разтвор на пробата Инжектира се екстракт от пробата (5.2) няколко пъти, като се използва същият обем като приетия за калибриращите разтвори и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс. 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс на разтвора се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието на олахиндокс в пробата се определя със следната формула: w = \frac{c.1000}{m} в която: w е съдържанието в mg/kg; c – концентрацията на олахиндокс в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml; m – масата на изпитваната част в g (5.2). 7. Установяване на достоверността на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2) и на калибриращия разтвор, съдържащ 5,0 µg/ml. Само височината на пика на олахиндокс трябва да се увеличи, след като се вземат предвид както добавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъде в рамките на \pm 10\% от оригиналната широчина на пика на олахиндокс на неподсилен екстракт на разтвора. Диодна полева детекция Резултатите се оценяват съгласно следните критерии: (a) дължината на вълната на максимална оптична плътност на пробата и на еталонните спектри, записани при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена от разрешаващата способност на системата за детекция. За диодната детекция тя типично е в рамките на \pm 2 nm. (b) между 220 и 400 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика на хроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % от относителната оптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от оптичната плътност на спектъра на еталонния аналит; (в) между 220 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика, произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % на относителна оптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % от оптичната плътност на спектъра във връхната точка на пика. Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава 15 % от най-високия резултат за съдържание на олахиндокс между 10 и 200 mg/kg. 7.3. Възстановяване За една подсилена празна проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от съвместното изследване При провеждане на съвместно изследване, при което 4 мостри на храни за прасенца, включително една празна проба, са анализирани в 13 лаборатории, се получават резултатите, дадени в таблицата: Мостра 1 Мостра 2 Мостра 3 Мостра 4 L 13 10 11 11 n 40 40 44 44 Средноаритметична стойност (mg/kg) - 14,6 48,0 95,4 S_t (mg/kg) - 0,82 2,05 6,36 S_R (mg/kg) - 1,62 4,28 8,42 CV_t (%) - 5,6 4,3 6,7 CV_R (%) - 11,1 8,9 8,8 Номинално съдържание (mg/kg) - 15 50 100 Възстановяване (%) - 97,3 96,0 95,4 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на възпроизводимост; S_t – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_t – коефициент на вариации на възпроизводимост; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост. 9. Забележка Въпреки че методът не е утвърден за храни, съдържащи повече от 100 mg/kg олахиндокс, могат да бъдат получени задоволителни резултати, като се използва по-малка проба за анализ и/или като се разреди екстрактът (5.2), така че да се постигне концентрация в рамките на калибриращата графика (5.3.2). XXI. Методи за определяне на нишесте ПОЛАРИМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Чрез този метод може да се определи нивото на нишестето и високомолекулните продукти от неговото разграждане в продуктите за изхранване на животни, с изключение на онези от тях, които съдържат цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изсушена горна част на цвеклото и листата, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (например резенки и брашно от земна ябълка). 2. Принцип Методът включва две определяния. В първото пробата се обработва докато е гореща с разредена солна киселина. След избистряне и филтруване се определя въртенето на поляризираната светлина от разтвора чрез поляриметрия. Във второто пробата се екстрахира с 40% етанол. След подкисляване със солна киселина, избистряне и филтруване въртенето на поляризираната светлина се измерва както в първото определяне. Разликата между двете измервания, умножено по известен коефициент, дава количеството на нишестето в пробата. 3. Реактиви: 3.1. 25% (о/о) солна киселина, плътност 1,126; 3.2. 1,128% (т/о) солна киселина. Концентрацията трябва да бъде проверена чрез титруване с 0,1 N разтвор на натриева основа в присъствие на 0,1% (т/о) метилрот в 94%-ен (о/о) етанол. 10 ml солна киселина са еквивалентни на 30,94 ml 0,1 N натриева основа. 3.3. Разтвор I на Carrez – разтварят се 21,9 g цинков ацетат Zn(CH_3COO)_2.2H_2O и 3 g ледена оцетна киселина във вода. Долива се до 100 ml с вода. 3.4. Разтвор II на Carrez – разтварят се 10,6 g калиев фероцианид K_4(Fe(CN)_6).3H_2O във вода. Долива се до 100 ml с вода. 3.5. 40% (о/о) етанол, плътност: 0,948 при 20°C. 4. Апаратура: 4.1. ерленмайерова колба от 250 ml със стандартна шлифова запушалка и с обратен хладник; 4.2. поляриметър или захарометър. 5. Процедура 5.1. Подготовка на пробата Пробата се раздробява докато стане достатъчно дребна, за да премине през сито с кръгли отвори 0,5 mm. 5.2. Определяне на общото въртене на поляризираната светлина (P или S) (виж наблюдение 7.1). Претеглят се 2.5 g от раздробената проба с точност до милиграм и се поставят в мерителна колба от 100 ml. Прибавят се 25 ml солна киселина (3.2), разклаща се до получаване на хомогенно разпределение на изследваната проба и се прибавят още 25 ml солна киселина (3.2). Колбата се поставя в кипяща водна баня при енергично и постоянно разклащане през първите 3 min, за да се предотврати образуването на агломерати. Количеството на водата във водната баня трябва да бъде достатъчно, така че тя да не престане да кипи при потапяне на колбата в нея. Колбата не трябва да се изважда от водната баня при разклащането. След точно 15 min колбата се изважда от водната баня, добавят се 30 ml студена вода и се охлажда незабавно до 20 °C. Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.3) и се разклаща в продължение на една минута. След това се добавят 5 ml разтвор II на Carrez (3.4) и се разклаща отново в продължение на 1 min. Обемът се допълва с вода, хомогенизира се и се филтрува. Ако филтратът не е съвършено прозрачен (което е рядкост), определянето се повтаря, като се използват по-големи количества от разтворите I и II на Carrez, например 10 ml. С поляриметър или захарометър се измерва въртенето на поляризираната светлина на разтвора в кювета с дължина 200 mm. 5.3. Определяне въртенето на поляризираната светлина (P' или S') на субстанции, разтворими в 40%-ен етанол. Претеглят се 5 g от пробата с точност до 1 mg, пренасят се в мерителна колба от 100 ml и се добавят около 80 ml етанол (3.5) (виж наблюдение 7.2). Колбата се оставя за един час при стайна температура, като през това време шесткратно се разклаща енергично, така че пробата напълно да се смеси с етанола. Обемът се допълва с етанол (3.5), хомогенизира се и се филтрува. 50 ml от филтрата (равняващи се на 2,5 g от пробата) се пипетират в ерленмайерова колба от 250 ml, добавят се 2,1 ml солна киселина (3.1) и се разклаща енергично. Обратният хладник се прикрепва към ерленмайеровата колба и тя се потапя в кипяща водна баня. Точно след 15 min ерленмайеровата колба се изважда от водната баня, съдържанието ѝ се прехвърля в мерителна колба от 100 ml, като се изплаква с малки количества студена вода и се охлажда до 20°C. Пробата се избистря с разтворите I (3.3) и II (3.4) на Carrez, обемът се допълва с вода, хомогенизира се, филтрува се и се измерва въртенето на поляризираната светлина, както е указано във втория и третия абзац на т. 5.2. 6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на нишесте в проценти се изчислява по следната формула: 6.1. Съдържание, определено с поляриметър: \text{проценти нишесте} = \frac{(P - P^1)}{[a]_D^{20^\circ}}, където: P е общата оптична ротация в градуси; P1 – общата оптична ротация в градуси на разтвор от 40% етанол; [a]D20^\circ – специфичната оптична ротация на чисто нишесте; общоприетите стойности са: + 185,9° – оризово нишесте, + 195,4° – картофено нишесте, + 184,6° – царевично нишесте, + 182,7° – пшенично нишесте, + 181,5° – ечемичено нишесте, + 181,3° – овесено нишесте, + 184,0° – други типове нишесте и други смеси, съдържащи нишесте в комбинираните фуражи. 6.2. Съдържание, определено със захариметър: \text{проценти нишесте} = \frac{2000}{[a]_D^{20^\circ}} \cdot [(2N.0,665)(S - S^1)] = \frac{26 - 6N(S - S^1)}{[a]_D^{20^\circ}} където: S е общата оптична ротация в захарни градуси; S1 – общата оптична ротация в захарни градуси на разтвор от 40% етанол; N – теглото на захарозата в g в 100ml вода, даващо оптична ротация от 100 захарометрични градуса в 200 mm тръба. Теглото варира в съответствие от използването на различни видове захарометри: 16,29 g – за френски захарометри; 26,00 g – за немски захарометри; 20,00 g – за други захарометри; [a]D20^\circ – специфичната оптична ротация на чисто нишесте (виж 6.1). 6.3. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, отнасяща се за една и съща проба, не трябва да надвишава 0,4, измерено в абсолютна стойност при съдържание на нишесте под 40% и 1% относителна стойност за съдържащи нишесте над 40%. 7. Наблюдения 7.1. Ако пробата съдържа повече от 6% карбонати, пресметнати като калциев карбонат, преди определяне на общото въртене на поляризираната светлина те трябва да бъдат разградени чрез обработка с точно определено количество сярна киселина. 7.2. В случай на продукти с високо съдържание на лактоза, такива като пулверизирана сушена суроватка или обезмаслено мляко на прах, след прибавянето на 80 ml етанол (3.5) се процедира, както следва: прикрепва се обратният хладник към колбата и тя се потапя във водна баня при 50°C за 30 min. Оставя се да изстине и анализът продължава, както е указано в 5.3. XXII. Определяне на общото количество суров белтък 1. Цел и обхват – методът дава възможност да се определи общото количество суров белтък в хранителните вещества на базата на азотно съдържание, определяно по метода на Kjeldahl. 2. Принцип – пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Серният рартвор се алкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в мерно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид. 3. Реагенти: 3.1. калиев сулфат; 3.2. катализатор – меден оксид (II) или меден сулфат пентахидрат, CuSO4.5H2O; 3.3. гранулиран цинк; 3.4. сярна киселина, r20 = 1,84 g/ml; 3.5. сярна киселина (H2SO4) = 0,5 mol/l; 3.6. сярна киселина (H2SO4) = 0,1 mol/l; 3.7. метил червен индикатор – разтваря се 300 mg червен метил в 100 ml етанол, s = 95 – 96% (v/v); 3.8. разтвор на натриев хидроксид (трябва да се използва техническо качество) V = 40 g / 100 ml (t/V:40%); 3.9. разтвор на натриев хидроксид c = 0,25 ml/l; 3.10. разтвор на натриев хидроксид c = 0,1 mol/l; 3.11. гранулиран камък пемза, измит в солна киселина и запален; 3.12. ацетанилид (т.р. = 114 °C, N = 10,36%); 3.13. захароза (без азот). 4. Апарат – подходящ за кипене, дестилация и титрация, по процедурата на Кйелдал. 5. Процедура 5.1. Кипене – отмерва се 1 g от пробата с точност 0,001 g и пробата се прехвърля в колбата на апарата за кипене. Прибавят се 15 g натриев сулфат (3.1), подходящо количество катализатор (3.2) (от 0,3 до 0,4 g меден оксид (II) или от 0,9 до 1,2 g меден сулфат пентахидрат (II), 25 ml сярна киселина (3,4) и няколко гранули пемзен камък (3.11) и се разбърква. Колбата се нагрява първоначално бавно, като от време на време се бърка, докато масата се карбонизира и изчезне пяната; след това се нагрява по-интензивно, докато течността изцяло закипи. Нагряването е подходящо, ако врящата киселина се кондензира по стените на колбата. Следва да се внимава стените да не прегреят и органични частички да не прилепват към тях. Когато разтворът се избистри и стане бледозелен, се продължава да се вари още 2 h, след което се оставя, за да се охлади. 5.2. Дестилация – внимателно се добавя достатъчно вода, за да се осигури пълно разтваряне на сулфатите, охлажда се и след това се прибавят няколко гранули цинк (3.3). В събирателната колба на апарата за дестилация се поставя точно измерено количество от 25 ml сярна киселина (3.5) или (3.6) в зависимост от предполагаемото съдържание на азот. Добавят се няколко капки червен метилов индикатор (3.7). Колбата за кипене се свързва към кондензатора на дестилационния апарат и краят на кондензатора се потапя в течността от събирателната колба на дълбочина поне 1 cm (виж наблюдение 8.3). Бавно се изсипват 100 ml разтвор от натриев хидроксид (3.8) в колбата за кипене, без загуба на амоняк (виж наблюдение 8.1). Колбата се нагрява, докато амонякът се дестилира. 5.3. Титрация – излишното количество сярна киселина в събирателната колба се титрира с разтвор от натриев хидроксид (3.9) или (3.10) в зависимост от концентрацията на използваната сярна киселина, докато се достигне крайната точка. 5.4. Контролен тест В потвърждение на това, че реагентите не съдържат азот, се извършва контролен тест (кипене, дестилация, титрация) с 1 g захароза (3.13) вместо пробата. 6. Калкулиране на резултатите Съдържанието на общото количество белтък се извършва по следната формула: (V_0 \cdot V_1) \cdot c = 0,014 \cdot 100 \cdot 6,25 \cdot t, където: V_0 е обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в теста с контролната проба; V_1 – обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в титрацията на пробата; c – концентрацията (mol/l) на натриев хидроксид (3.9 или 3.10); t – масата [g] на пробата. 7. Сверяване, поверка на метода 7.1. Повторяемост Разликата между резултатите от двете паралелни определяния, извършвани с една и съща проба, не трябва да превишават: • 0,2% в абсолютна стойност – за съдържанието на общ белтък по-малко от 20%; • 1,0% отнесен към по-високато стойност – за съдържанието на общ белтък от 20% до 40%; • 0,4% в абсолютна стойност – за съдържанието на общ белтък повече от 40%. 7.2. Точност Анализът (кипине, дестилация, титрация) се извършва с от 1,5 до 2,0 g ацетанилид (3.12) в присъствието на 1 g захароза (3.13); 1 g ацеталинид консумира 14,80 ml сярна киселина (3.5). Възвращаемостта (оползотворяването) трябва да бъде поне 99%. 8. Наблюдение 8.1. Апарътът следва да бъде от ръчен, полуавтоматичен или автоматичен тип. Ако апарътът изисква прехвърляне между стъпките на кипенето и дестилацията, трансферът се извършва без загуба. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с капкомерна фунийка, се добавя натриев хидроксид веднага преди свързването на колбата с кондензатора, като течността се изсипва бавно по стените. 8.2. Ако кипящото вещество се втвърди, отново се започва определянето с по-големи количества сярна киселина (3.4), отколкото е указано. 8.3. За продукти с ниско съдържание на азот обемът на сярната киселина (3.6), който се поставя в събирателната колба, може да се намали, ако е необходимо, до 10 или 15 ml и да се добави до 25 ml с вода. XXIII. Определяне на суров протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи фракцията на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина при определени условия. Той е приложим при всички продукти за изхранване на животни. 2. Принцип Пробата се нагрява в продължение на 48 h при 40°C в разтвор на пепсин хидрохлорид. Суспенсията се филтрува и съдържанието на азот във филтрата се определя по метода за определяне на суров протеин. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина, плътност 1,125; 3.2. 0,075 N солна киселина; 3.3. 2 единици / mg пепсин; активността на пепсина се определя по метод, описан в част 4 на това приложение, и трябва да бъде установена в съответствие с този метод; 3.4. около 0,2% (т/о) свежо приготвен разтвор на пепсин в солна киселина (3.2); активност 400 единици/l; 3.5. емулсия за гасене на пяна (например силикон); 3.6. всички реактиви, изброени в т. 3. на метода за определяне на суров протеин. 4. Апаратура: 4.1. водна баня или термостат, регулиран на 40°C ± 1°C; 4.2. апарат за разлагане и дестилация по Kjeldahl. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвор (виж наблюдение 7.2.) Претеглят се 2 g от пробата с точност до mg и се пренасят в мерителна колба от 500 ml. Добавят се 450 ml разтвор на пепсин хидрохлорид (3.4), предварително нагрят до 40°C, и се разклаща, за да се предотврати образуването на агломерати. Проверява се рН на суспенсията да е по-малко от 1,7. Колбата се поставя във водна баня или в термостат (4.1) и се оставя там за 48 h. Разклаща се след 8, 24 и 32 h. След 48 h се прибавят 15 ml солна киселина (3.1), охлажда се до 20°C, обемът се допълва с вода и се филтрува. 5.2. Хидролизиране 250 ml от филтрата се пренасят в колбата на дестилационния апарат (4.2). Добавят се реагентите, необходими за хидролизата, указани във второто изречение на т. 5.1 от метода за определяне на суров протеин. Хомогенизира се и се довежда до кипене. Ако се образува пяна, се добавят няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.5). Кипенето продължава енергично докато водата се изпари почти напълно. Намалява се нагряването и последните следи от вода внимателно се отстраняват. Когато разтворът се избистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор, съдържащ мед), кипенето продължава още 1 h. Оставя се да изстине. 5.3. Дестилация и титруване. Процедира се, както е указано в т. 5.2 и 5.3 от метода за определяне на суров протеин. 5.4. Празна проба Празната проба се прави, като се прилага същата процедура с пропускане на пробата, която трябва да бъде анализирана. 6. Пресмятане на резултатите Обемът на сярната киселина, използвана при празната проба, се изважда от обема, използван при изследваната проба. 1 ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,4 като абсолютна стойност, при съдържание по-малко от 20%; • 2,0% като относителна стойност, при съдържание не по-малко от 20% и не повече от 40%; • 0,8 като абсолютна стойност, при съдържание повече от 40%. 7. Наблюдения 7.1. Стойностите, получени чрез този метод нямат непосредствена пряка връзка със смилаемостта in vivo. 7.2. Продукти, съдържащи повече от 10% масла или мазнини, трябва първо да бъдат обезмаслени чрез екстрахиране с петролев етер (точка на кипене 40 – 60°C). XXIV. Определяне активността на пепсин 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи активността на пепсина, който се използва при определяне на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина. 2. Принцип Хемоглобинът се обработва при определени условия с пепсин в среда, съдържаща солна киселина. Нехидролизираната фракция на протеина се преципитира с трихлороцетна киселина. Към филтрата се прибавят натриева основа и реактив на Folin-Ciocalteu. Оптичната плътност на разтвора се измерва при 750 nm и количеството на тирозина се определя по калибровъчна крива. Определение – за единица пепсин се приема това количество от този ензим, което в условията на метода освобождава за 1 min такова количество хидроксиарилни групи, които, оцветени с реактива на Folin-Ciocalteu, имат оптична плътност, съответстваща на оптичната плътност на 1 µmol тирозин, оцветен по същия начин. 3. Реактиви: 3.1. 0,2 N солна киселина. 3.2. 0,06 N солна киселина. 3.3. 0,025 N солна киселина. 3.4. 5% разтвор (т/о) на трихлороцетна киселина. 3.5. 0,5 N разтвор на натриева основа. 3.6. Реактив на Folin-Ciocalteu. В облодънна колба от 2 l със стандартно шлифовано гърло се поставят 100 g натриев волфрамат (\text{Na}_2\text{WO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}), 25 g натриев молибдат (\text{Na}_2\text{MoO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}) и 700 ml вода. Прибавят се 50 ml фосфорна киселина (плътност 1.71) и 100 ml концентрирана солна киселина (плътност 1.19), колбата се свързва с обратен хладник, нагрява се до завиране и в продължение на 10 h се поддържа слабо кипене. Оставя се да изстине, демонтира се хладникът и се добавят 175 g литиев сулфат (\text{Li}_2\text{SO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}), 50 ml вода и 1 ml бром. Вари се 15 min, за да се отстрани излишъкът от бром. Разтворът се оставя да изстине, пренася се в мерителна колба от 1 l, обемът се допълва с вода, разбърква се и се филтрува. Не трябва да остава зеленикаво оцветяване. Преди употреба реактивът се разрежда с вода в съотношение 1:2. 3.7. Разтвор на хемоглобин. Претегля се количество хемоглобин (около 2 g белтъчен субстрат, определен по Anson), съответстващо на 354 mg азот (1) и се пренася в колба от 200 ml със стандартно шлифово гърло. Прибавят се няколко ml солна киселина (3.2), колбата се свързва с вакуумпомпа и се разклаща, докато хемоглобинът се разтвори напълно. Вакуумът се освобождава и обемът се допълва до 100 ml със солна киселина при разклащане. Приготвя се непосредствено преди употреба. 3.8. Стандартен разтвор на тирозин – 181,2 mg тирозин се разтварят в солна киселина (3.1) и обемът се допълва до 1 l със същата киселина (резервен разтвор). 20 ml от този разтвор се разреждат до 100 ml със солна киселина (3.1). 1 ml от този разтвор съдържа 0,2 \mumol тирозин. 4. Апаратура: 4.1. водна баня с температура 25,0 \pm 0,1^\circ\text{C}, контролирана от ултратермостат; 4.2. спектрофотометър; 4.3. хронометър с точност 1 sec; 4.4. pH-метър. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора (виж наблюдение 7.1) 150 mg пепсин се разтварят в 100 ml солна киселина (3.2). 2 ml от този разтвор се пренасят с пипета в мерителна колба от 50 ml и обемът се допълва със солна киселина (3.3). pH на разтвора, проверен с pH-метър, трябва да бъде 1,6 \pm 0,1. Колбата се потапя във водната баня (4.1). 5.2. Хидролизиране 5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25^\circ\text{C} във водната баня (4.1), прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1, и се разбърква със стъклена пръчка с удебелен край, като се правят около 10 движения напред – назад. Епруветката се инкубира във водната баня при 25^\circ\text{C} в продължение на точно 10 min, считано от момента на прибавянето на пепсиновия разтвор (продължителността и температурата трябва стриктно да се съблюдават). Прибавят се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25^\circ\text{C}, разбърква се и се филтрува през сух филтър. 5.3. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност 5 ml от филтрата се пренасят с пипета в ерленмайерова колба от 50 ml, добавят се 10 ml разтвор на натриева основа (3.5) и при постоянно разклащане се добавят 3 ml разреден реактив на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плътност на разтвора се определя след 5 до 10 min със спектрофотометър при дължина на вълната 750 nm и кювета с дебелина 1 cm срещу вода. 5.4. Празна проба При всяко определяне се прави празна проба, както следва: 5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25^\circ\text{C} във водната баня (4.1), прибавят се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25^\circ\text{C}, разбърква се, прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1. Разбърква се със стъклена пръчка и епруветката се оставя във водната баня (4.1) при 25^\circ\text{C} точно за 10 min. Разбърква се и се филтрува през сух филтър. Процедурата продължава, както е описано в т. 5.3. 5.5. Калибровъчна крива В ерленмайерови колби от 50 ml се пренасят аликвоти от 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 ml от стандартния разтвор на тирозин (3.8), отговарящи съответно на 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 \mumol тирозин. Серията се допълва със разтвор, несъдържащ тирозин. Обемите се довеждат до 5 ml със солна киселина (3.1). Добавят се 10 ml разтвор на натриева основа (3.5) и при постоянно разбъркване се добавят 3 ml разреден разтвор на реактива на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плътност се измерва както е указано в последното изречение на т. 5.3. Калибровъчната крива се начертава, като стойностите за оптичната плътност се нанасят срещу стойностите, съответстващи на количествата на тирозина. 6. Преслиятане на резултатите От калибриращата крива се отчита количеството на тирозин в mol, съответстващо на оптическата гъстота на цветния разтвор, коригиран на основа на празната проба. Активността на пепсина в mol на тирозина при 25^\circ\text{C} на mg за min се изчислява при следната формула: \text{Свързване в mg (U/mg)} = \frac{0,32a}{p}, където: a е количеството тирозин в mol, отчетено на калибриращата крива; p – теглото в mg на количеството пепсин, посочено в 5.2. 7. Наблюдения 7.1. Количеството на разтворения пепсин трябва да бъде такова, че при фотометричните измервания в края и началото на серията оптичната плътност да бъде в границите между 0,035 и 0,35. 7.2. Две единици / mg, получени по този метод, отговарят на: 3,64 милиединици / mg по Anson (\mumol тирозин / mg / min при 35,5^\circ\text{C}) или 36 400 търговски единици / g (\mumol тирозин / g /10 min при 35,5^\circ\text{C}). XXV. Определяне на свободен и общ госипол 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят нивото на свободния госипол, общият госипол и химически сродните субстанции в памучно семе, брашно от памучно семе, в кюспе от памучно семе и в комбинирани продукти за изхранване на животни, съдържащи тези субстанции, когато концентрацията надвишава 20 ppm. 2. Принцип Свободният госипол се определя чрез екстракция в присъствие на 3-аминопропан-1-ол или със смес от пропан-2-ол и хексан. Общият госипол се определя чрез екстракция с диметилформамид. Чрез анилин госиполът се превръща в госипол-дианилин, чиято оптическа плътност се измерва при 440 nm. 3. Реактиви: 3.1. смес от пропан-2-ол и хексан: 60 обемни части пропан-2-ол ч.з.а. се смесват с 40 обемни части n-хексан; 3.2. разтворител A – в еднолитрова мерителна колба се смесват около 500 ml от сместа пропан-2-ол и хексан (3.1) 2 ml 3-аминопропан-1-ол, 8 ml ледена оцетна киселина и 50 ml вода. Обемът се допълва със смес от пропан-2-ол и хексан (3.1). Този реактив е стабилен в продължение на една седмица. 3.3. Разтворител Б - в мерителна колба от 100 ml се пренасят с пипета 2 ml 3-аминопропан-1-ол и 10 ml ледена оцетна киселина. Охлаждат се до стайна температура и обемът се допълва с N,N-диметилформамид. Този реактив е стабилен в продължение на една седмица. 3.4. Анилин, ч.з.а. – ако оптическата плътност на празната проба надвишава 0,022, анилинът се дестилира над цинков прах, като се отстраняват първите и последните 10% от дестилата. Охлажда се и се съхранява в кафява бутилка с шлифова запушалка. Този реактив се съхранява няколко месеца. 3.5. Стандартен разтвор А на госипол - в мерителна колба от 250 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат. Разтваря се и обемът се допълва с разтворител А (3.2). 50 ml от този разтвор се пренасят в мерителна колба от 250 ml и обемът се допълва с разтворител А. Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,02 mg/ml. Преди употреба се оставя в продължение на един час при стайна температура. 3.6. Стандартен разтвор Б на госипол – в мерителна колба от 50 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат. Разтваря се и обемът се допълва с разтворител Б (3.3). Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,5 mg/ml. Стандартните разтвори А и Б на госипол са стабилни в продължение на 24 h, ако се съхраняват на тъмно. 4. Апаратура: 4.1. клатачен апарат: около 35 оборота в min; 4.2. спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Изпитвана проба Количеството на пробата зависи от предполагаемото съдържание на госипола в нея. За предпочитане е да се работи с малка проба и относително голяма аликвота от филтрата, така че да се получи количество госипол достатъчно за прецизно спектрофотометрично измерване. За определяне на свободния госипол в памучно семе, брашно от памучно семе и в кюспе от памучно семе изследваната проба не трябва да надвишава 1 g. При определяне в смесени продукти за изхранване на животни пробата може да бъде 5 g. В повечето случаи е достатъчна аликвота от 10 ml от филтрата. Тя трябва да съдържа от 50 до 100 μg госипол. При определяне на общия госипол пробата трябва да бъде от 0,5 до 5 g, така че аликвота от 2 ml от филтрата да съдържа от 200 до 400 μg госипол. Анализът се провежда при стайна температура около 20°C. 5.2. Определяне на свободен госипол Пробата се пренася в колба от 250 ml с шлифовано гърло, като дъното на колбата трябва да е покрито с трошено стъкло. 50 ml от разтвор А (3.2) се добавят с пипета, колбата се запушва и се разбърква в продължение на 1 h на клатачния апарат. Филтрува се през сух филтър и филтратът се събира в малка колба с шлифовано гърло. По време на филтруването фунията се покрива с часовниково стъкло. Равни аликвоти от филтрата, съдържащ от 50 до 100 μg госипол, се пренасят в две мерителни колби (А и Б) от по 25 ml. Ако е необходимо, обемът се допълва до 10 ml с разтворител А (3.2). Обемът в колба А се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор се използва като стандартен и срещу него се измерват разтворите на пробата. В две други мерителни колби от 25 ml (В и Г) се пренасят с пипета по 10 ml от разтворител А (3.2). Обемът в колба В се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор се използва като стандартен и срещу него се измерва празната проба. Във всяка от колбите Г и Б се добавят по 2 ml анилин (3.4). Нагрява се в продължение на 30 min над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои 1 h. Оптическата плътност на празната проба Г се определя чрез сравняване със стандартния разтвор В. Оптическата плътност на пробата Б се определя чрез сравняване със стандартния разтвор А. Измерването се провежда на спектрофотометър при 440 nm, като се използва кювета с дебелина 1 cm. Оптическата плътност на празната проба се изважда от тази на изследваната проба (коригирана оптическа плътност). От тази стойност се пресмята количеството на свободния госипол, както е описано в т. 6. 5.3. Определяне на общия госипол Пробата, съдържаща от 1 до 5 mg госипол, се пренася в мерителна колба от 50 ml и се добавят 10 ml от разтворител Б (3.3). Едновремено с това се приготвя и празната проба като 10 ml от разтворител Б (3.3) се пренасят в друга мерителна колба от 50 ml. Двете колби се нагряват в продължение на 30 min над кипяща водна баня. Охлажда се до стайна температура, обемът на всяка от колбите се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Хомогенизира се и се оставя да се утаи в продължение на 10 – 15 min, след което се филтрува и филтратите се събират в колби с шлифови запушалки. В две мерителни колби от 25 ml се пренасят по 2 ml от пробата. В други две мерителни колби от 25 ml се пренасят по 2 ml от празната проба. Обемът на колбите от всяка серия се довежда до 25 ml със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Тези разтвори се използват като стандартни разтвори. В други две колби се пренасят по 2 ml анилин (3.4). Нагрява се в продължение на 30 min над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои в продължение на 1 h. Оптическата плътност се определя, както е описано в т. 5.2 за свободния госипол. От тази стойност се пресмята количеството на общия госипол, както е описано в т. 6. 6. Пресмятане на резултатите Резултатите могат да се изчислят или на база специфичната оптическа плътност (6.1), или на калибрираната крива (6.2). 6.1 На база специфичната оптическа плътност Специфичните оптически плътности при описаните условия ще бъдат: \begin{aligned} & 1\% \\ \text{свободен госипол} - E &= \frac{625}{1\text{cm}} , \\ \text{общ госипол} - E &= \frac{600}{1\text{cm}} . \end{aligned} Съдържанието на свободен или общ госипол на пробата се изчислява по формулата: \begin{aligned} & 1250 \text{ E} \\ \% \text{ госипол} &= \frac{1\%}{\text{E} \text{ — PA}} , \\ & 1\text{cm} \end{aligned} където: Е е коригираната оптическа плътност, определна съгласно 5.2; P – пробата за тест в g; A – аликвотната част от филтрата в ml. 6.2. На база на калибрираната крива Подготвят се 2 серии от пет 25ml-ови градуирани колби. Капват се съответно 2, 4, 6, 8 и 10 ml-ови части от стандартния разтвор на госипол A (3.5) във всяка серия от колби. Обемът се допълва до 10 ml с разтвор A (3.2). Комплектова се всяка серия с 25 ml-ова колба, съдържаща само 10 ml от разтвора A(3.2) (празен тест). Обемът на колбите на първата серия (вкл. колбата с празния тест) се допълва със смес от пропан-2-ол и хексан (3.1) до 25 ml (референтна серия). Прибавя се 2 ml анилин (3.4) във вторите серии (вкл. колбите за празния тест). Загрява се за 30 min на водна баня до получаване на цвета. Охлажда се до стайна температура и се определят стойностите на пропан-2-ол и хексановата смес (3.1). Хомогенизира се и се оставя да престои 1 h (стандартна серия). Определя се включената в 5.2 оптическа плътност (гъстота) на разтворите в стандартните серии в сравнение с кореспондиращите разтвори в споменатите серии. Установява се калибриращата крива (линия) чрез милиметроването на оптическата плътност към количествата на госипола (в μg). XXVI. Определяне на тилозин чрез дифузия в агар 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на тилозина в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm. 2. Принцип Пробата се обработва с разтвор на фосфатен буфер pH 8, след което се екстрахира с метанол. След центрофугиране екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на тилозина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика. 3. Микроорганизъм – Sarcina lutea, АТСС № 9341 3.1. Поддържане на родителския щам Инокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1), pH се довежда до 7,0. Инкубира се в течение на 24 h при около 35 °C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки месец се реинокулира скосен агар. 3.2. Приготвяне на бактериална суспенсия Бактериите се събират в 2 до 3 ml физиологичен разтвор (4.4) от епруветка със скосен агар (3.1). С тази суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1), коригирана до pH 7,0. Култивира се в продължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор (4.4). Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75% при 650 nm. Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица. За различните концентрации на тилозин, които се използват, предварително се определя количеството на инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върху стъклени плочи с основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до 50°C. 4. Хранителна среда и реактиви 4.1. Основна среда за определянето: глюкоза – 1 g; трипсинов пептон – 10 g; месен екстракт – 1,5 g; дрождев екстракт – 3 g; агар в зависимост от качеството – от 10 до 20 g; дестилирана вода – до 1000 ml. За поддържане на родителския щам и за приготвяне на бактериалната суспенсия pH се коригира до 7,0 непосредствено преди употреба, а за определянето pH се довежда до 8,0. 4.2. Разтвор на фосфатен буфер с pH 8: монокалиев фосфат, \text{KH}_2\text{PO}_4, ч.з.а. – 0,523 g; дикалиев фосфат, \text{K}_2\text{HPO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}, ч.з.а. – 16,730 g; дестилирана вода – до 1000 ml. 4.3. Разтвор на фосфатен буфер с pH 7: монокалиев фосфат, \text{KH}_2\text{PO}_4, ч.з.а. – 5,5 g; дикалиев фосфат, \text{K}_2\text{HPO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}, ч.з.а. – 13,6 g; дестилирана вода – до 1000 ml. 4.4. Стерилен физиологичен разтвор. 4.5. Чист метанол. 4.6. 40%-ен (o/o) метанол. 4.7. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 60/40 по обем. 4.8. Стандартна субстанция: тилозин с известна активност. 5. Стандартни разтвори Стандартната субстанция (4.8) се суши в продължение на 3 h при 60°C във вакуумна сушилня (5 mm Hg стълб). Претеглят се от 10 до 50 mg в мерителна колба, разтварят в 5 ml метанол (4.5) и се разрежда с разтвора на фосфатния буфер, pH 7 (4.3), така че да се получи основна концентрация на тилозина 1000 \mu\text{g/ml}. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.7) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 2 \mu\text{g/ml} тилозин – основа. Като се използва сместа (4.7), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: \text{S}_4 – 1 \mu\text{g/ml}; \text{S}_2 – 0,5 \mu\text{g/ml}; \text{S}_1 – 0,25 \mu\text{g/ml}. 6. Екстракция За концентратите се взема проба от 10 g; за премиксите и за продуктите за изхранване на животни – 20 g. Добавят се 60 ml разтвор на фосфатен буфер pH 8 (4.2), предварително нагрят до 80°C, и се хомогенизира в продължение на 2 min (домашен миксер, Ultra-turrax и др.). Оставя се в продължение на 10 min, добавят се 40 ml метанол и се хомогенизира в продължение на 5 min. Екстрактът се центрофугира, аликвотна част се разрежда със сместа (4.7), за да се получи предполагаема концентрация на тилозина 2 \mu\text{g/ml} (= \text{U}_8). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.7), се приготвят концентрациите \text{U}_4, \text{U}_2 и \text{U}_1. При съдържание по-малко от 10 ppm екстрактът се изпарява до сухо на ротационен изпарител при 35°C и остатъкът се разтваря в 40%-ен метанол (4.6). 7. Метод за определяне 7.1. Инокулиране на хранителната среда Основната среда за определянето (4.1), коригирана до pH 8, се инокулира с бактериалната суспенсия (3.2.) при температура от 48 до 50°C. 7.2. Подготовка на паничките Дифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (\text{S}_8, \text{S}_4, \text{S}_2, \text{S}_1) и четири концентрации на екстракта (\text{U}_8, \text{U}_4, \text{U}_2, \text{U}_1). Във всяка паничка трябва да бъдат разположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта. За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направени най-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда (7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да се провежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между 0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика. За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране. 7.3. Инкубиране Паничките се инкубират в продължение на 24 h при 35 до 37°C. 8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полулогаритмична хартия, като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (\text{U}_1 + \text{U}_2 + \text{U}_4 + \text{U}_8 - \text{S}_1 - \text{S}_2 - \text{S}_4 - \text{S}_8) 0,602 \text{U}_4 + \text{U}_8 + \text{S}_4 + \text{S}_8 - \text{U}_1 - \text{U}_2 - \text{S}_1 - \text{S}_2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност. 9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават 10% като относителна стойност. XXVII. Определяне на виржиниамицин чрез дифузия в агар 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на виржиниамицин в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с Tween80 – метанолов разтвор. След центрофугиране и филтруване екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на виржиниамицина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика. 3. Микроорганизъм – Sarcina lutea, АТСС № 9341 3.1. Поддържане на родителския щам Инокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1). Инкубира се в течение на 24 h при около 35°C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки 14 дни се реинокулира скосен агар. 3.2. Приготвяне на бактериална суспенсия Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) в 2 до 3 ml физиологичен разтвор (4.3). С тази суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1). Култивира се в продължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор (4.3). Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75% при 650 nm. Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица. За различните концентрации на виржиниамицин, които се използват, предварително се определя количеството на инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върху стъклени плочи с основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до 50°C. 4. Хранителна среда и реактиви 4.1. Основна среда за определянето: глюкоза – 1 g; трипсинов пептон – 10 g; месен екстракт – 1,5 g; дрождев екстракт – 3 g; агар, взависимост от качеството – от 10 до 20 g; дестилирана вода – до 1000 ml; pH се коригира до стойност 6,5 преди употреба. 4.2. Разтвор на фосфатен буфер с pH 6: монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а. – 8,0 g; дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а. – 2,0 g; дестилирана вода – до 1000 ml. 4.3. Стерилен физиологичен разтвор. 4.4. Чист метанол. 4.5. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 80/20 по обем. 4.6. 0,5%-ен (т/о) разтвор на Tween80 в метанол. 4.7. Стандартна субстанция: виржиниамицин с известна активност. 5. Стандартни разтвори Приготвя се метанолов разтвор на стандартната субстанция (4.7), съдържащ 800 µg/ml виржиниамицин. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.5) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 1 µg/ml виржиниамицин. Като се използва сместа (4.5), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: S4 – 0,5 µg/ml; S2 – 0,25 µg/ml; S1 – 0,125 µg/ml. 6. Екстракция 6.1. Продукти със съдържание на виржиниамицин 50 ppm или по-малко Взема се проба от 10 до 20 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, вземат се 20 ml от чистия разтвор и се изпаряват до сухо на ротационен изпарител. Утайката се разтваря в 20 ml или повече от сместа (4.5), за да се получи предполагаема концентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U8). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.5), се приготвят концентрациите U4, U2 и U1. 6.2. Продукти със съдържание на виржиниамицин повече от 50 ppm Взема се проба от 1 до 10 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, филтратът се разрежда със сместа (4.5), за да се получи предполагаема концентрация на виржиниамицин 1µg/ml (= U8). След това се приготвят концентрациите U4, U2 и U1, както е указано в т. 6.1. 7. Метод за определяне 7.1. Инокулиране на хранителната среда Основната среда за определянето (4.1) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при температура от 48 до 50°C. 7.2. Подготовка на паничките Дифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четири концентрации на екстракта (U8, U4, U2, U1). Във всяка паничка трябва да бъдат разположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта. За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направени най-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда (7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да се провежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между 0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика. За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране. 7.3. Инкубиране Паничките се инкубират в продължение на 18 h при 28 до 30°C. 8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полу-логаритмична хартия като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) = 0,602 U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност. 9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишава 10% като относителна стойност. 9.1. Може да бъде използвана всяка друга търговска хранителна среда, която има подобен състав и дава подобни резултати. 9.2. Амидошварц се използва, за да направи видими зоните на инхибиране на стандартните разтвори (син пръстен). 9.3. Този щам, изолиран от LUFA в Кил, расте по-бързо, отколкото S. aureus ATCC 6538 P. 9.4. Щам, изолиран от LUFA в Кил. XXVIII. Определяне на влага в животински и растителни мазнини и масла 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят водата и летливите субстанции, съдъжащи се в животински и растителни мазнини и масла. 2. Принцип Пробата се изсушава до постоянно тегло при 103°C. Загубата на маса се определя чрез претегляне. 3. Апаратура: 3.1. плоскодънно блюдо от корозионноустойчив материал с диаметър от 8 до 9 cm и приблизителна височина 3 cm; 3.2. живачен термометър с усилен резервоар и разширение в горната част на капиляра, градуиран от около 80°C до най-малко 110°C и дълъг приблизително 10 cm; 3.3. пясъчна баня или електрически котлон; 3.4. ексикатор, съдържащ ефикасен сушител; 3.5. аналитични везни. 4. Процедура В сухото тарирано блюдо (3.1), в което е поставен термометърът (3.2), се претеглят с точност до 1 mg около 20 g от хомогенизираната проба. Нагрява се върху пясъчната баня или котлона (3.3), като се разбърква непрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90°C за около 7 min. Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното на блюдото. Температурата не трябва да надвишава 105°C. Като се продължава разбъркването, се изстъргва дъното на блюдото, докато престанат да се образуват мехури. За да се осигури напълно отстраняване на влагата нагряването се повтаря няколко пъти до 103 ± 2°C с охлаждане до 93°C между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (3.4) и се претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на маса между две последователни претегляния не надвишава 2 mg. Забележка: Увеличаването на масата на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване на мазнината. В този случай резултатът се пресмята от претеглянето, проведено непосредствено преди масата да започне да нараства. 5. Пресмятане на резултата Съдържанието на влага като процент от пробата се дава от следната формула: \frac{(M_1 - M_2) 100}{M_0}, където: M_0 е масата на изследваната проба, в g; M_1 – масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, преди сушене, в g; M_2 – масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, след сушене, в g. Резултати, по-ниски от 0,05%, трябва да се записват като „по-ниско от 0,05%“. Повторяемост Разликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05% като абсолютна стойност. XXIX. Определяне на магнезий чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи количеството на магнезий в продукти за изхранване на животни. В частност той е подходящ за определяне съдържания на магнезий, по-ниски от 5%. 2. Принцип Пробата се опепелява и се разтваря в разредена солна киселина. Ако пробата не съдържа органични субстанции, тя се разтваря директно в разредена солна киселина. Разтворът се разрежда и съдържанието на магнезий се определя чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия с дължина на вълната 285,2 nm при сравняване със стандартни разтвори. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16; 3.2. концентрирана солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16; 3.3. магнезиева лента или жица, или магнезиев сулфат хептахидрат, изсушен при стайна температура; 3.4. разтвор на стронциева сол (хлорид или нитрат), отговарящ на 2,5% (т/о) стронций (= 76,08 g \text{SrC}_{12}\text{H}_2\text{O}, ч.з.а., или 60,38 g \text{Sr}(\text{NO}_3)_2, ч.з.а.); 3.5. стандартен разтвор на магнезий: претегля се с точност до 1 mg 1 g магнезий (3.3), от чиято повърхност предварително внимателно са отстранени окисите, или съответно количество (10,143 g) магнезиев сулфат хептахидрат (3.3); пренася се в мерителна колба от 1000 ml, добавят се 80 ml солна киселина (3.1), оставя се да се разтвори и обемът се долива до 1000 ml с вода; 1 ml от този разтвор съдържа 1 mg магнезий. 4. Апаратура: 4.1. тигли от платина, кварц или порцелан; 4.2. термостатируема електрическа муфелна пещ; 4.3. атомно абсорбционен спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвор от пробата 5.1.1. Продукти за изхранване на животни, съставени изключително от неорганични субстанции В мерителна колба от 500 ml с 250 до 300 ml вода се претеглят с точност до 1 mg 5 g от пробата. Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), довежда се до кипене и течността се оставя да кипи леко в продължение на 30 min. Оставя се да изстине, обемът се допълва с вода, размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. В присъствие на силикати проба от 5 g се обработва с достатъчно количество (15 – 30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася в пещ с температура 105°C за 1 h. По-нататък се процедира, както е указано в третото изречение на т. 5.1.2. 5.1.2. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от минерални субстанции В тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се получи пепел, свободна от въглени частици, и се оставя да изстине. За да се отстранят силикатите, към пепелта се добавя достатъчно количество (15 – 30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася в сушилня при 105°C за 1 h. Остатъкът се обработва с 10 ml солна киселина (3.1) и с топла вода се пренася в мерителна колба от 500 ml. Оставя се да се охлади и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. 5.1.3. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от органични субстанции В тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се получи пепел, свободна от въглени частици. Пробата се обработва с 5 ml солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и след това се суши за един час в сушилня при 105°C, за да се стопят неразтворимите силикати. Пепелта се обработва с 5 ml солна киселина (3.1), пренася се с топла вода в мерителна колба от 250 ml, довежда се до кипене, оставя се да изстине и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. 5.2. Измерване чрез атомна абсорбция Чрез разреждане на стандартния разтвор (3.5) с вода се приготвят най-малко пет сравнителни разтвора с нарастващи концентрации, отговарящи на оптималния измервателен диапазон на спектрофотометъра. Във всеки разтвор се добавят 10 ml от разтвора на стронциева сол (3.4) и обемът им се довежда до 100 ml с вода. Една аликвотна част от филтрата, получен по т. 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3 се разреждат с вода така, че да се получи концентрация на магнезий, която е в границите на концентрацията на сравнителните разтвори. Концентрацията на солна киселина в този разтвор не трябва да надвишава 0,4 N. Добавят се 10 ml разтвор на стронциева сол (3.4) и обемът се допълва до 100 ml с вода. Абсорбцията на определяемия разтвор и на сравнителните разтвори се измерва при дължина на вълната 285,2 nm. 6. Пресмятане на резултатите Количеството на магнезия в пробата се пресмята по отношение на сравнителните разтвори. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 5% в относителна стойност. XXX. Определяне на сурови влакнини 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне в продукти за изхранване на животни количеството на органичните субстанции, които не съдържат мазнини и са неразтворими в кисели и алкални среди. Обикновено те се означават като сурови влакнини. 2. Принцип Пробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиева основа с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтруване в присъствие на азбест, измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при 900°C. Загубата на тегло в резултат на опепеляването отговаря на грубото влакно, присъстващо в изследваната проба. 3. Реактиви: 3.1. сярна киселина 0,26 N; 3.2. обработен азбест: Към азбест от същия тип, който се използва за тигел на Gooch, се добавя разредена солна киселина (1 обем солна киселина с плътност 1,19 + 3 обема вода) в обем пет пъти по-голям от обема на азбеста. Сместа се кипи за около 45 min, оставя се да изстине и се филтрува през фуния на Buechner. Остатъкът се мие първо с вода, докато изчезне солната киселина, и след това с ацетон (3.6). Азбестът се изсушава в сушилен шкаф и след това се накалява за 2 h при 900°C. Оставя се да изстине и се съхранява в шише с шлифова запушалка. Азбестът, обработен по този начин, може да се използва няколко пъти. Той трябва да отговаря на изискванията за празна проба, дадени в т. 5. 3.3. емулсия за пеногасене (напр. силикон); 3.4. разтвор на калиева основа 0,23 N; 3.5. солна киселина 0,5 N; 3.6. ацетон; 3.7. диетилов етер. 4. Апаратура: 4.1. бехерови чаши с обем най-малко 600 ml, с градуировка на нивото на 200 ml; 4.2. порцеланови дискове с диаметър около 80 mm и дебелина около 4 mm, перфорирани с приблизително 32 дупки, всяка от които с диаметър около 4 mm; 4.3. смукателно шише за гумена запушалка с капацитет около 2 l, с градуировка на нивото на 800 ml, комплектувано със стъклени фунии с диаметър 120 mm; 4.4. филтрувални дискове с диаметър 40 mm и дебелина около 4 mm, със скосен ръб, който да пасва на конуса на фунията (4.3), перфорирани с около 16 отвора, всеки от които с диаметър около 4 mm и покрити с мрежа с размер на отворите около 1 mm; както дисковете, така и мрежата трябва да бъдат устойчиви на киселини и основи; 4.5. тигли за изгаряне от платина или кварц; 4.6. термостатируема електрическа муфелна пещ; 4.7. ексикатор; 4.8. азбестов филтър: Суспендират се 2 g азбест (3.2) в 100 ml вода. Филтрува се под вакуум през филтрувален диск, покрит с метална мрежа (4.4), поставен във фунията на смукателното шише (4.3). Филтратът се събира и се филтрува още веднъж през същия филтър. Филтратът се отстранява. 5. Процедура В бехерова чаша (4.1) се претеглят с точност до 1 mg 3 g от пробата и 2 g обработен азбест (3.2), добавят се 200 ml сярна киселина (3.1) и няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.3). Нагрява се бавно до завиране и се оставя да се вари точно 30 min. За да се запази постоянен обемът, бехеровата чаша се покрива с приспособление за охлаждане, като например облодънна колба от 500 ml, в която циркулира студена вода. Кипенето се прекратява чрез добавяне на около 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се промива с пет порции от по приблизително 100 ml много гореща вода така, че да се получи краен обем на филтрата 800 ml. Остатъкът се пренася количествено в бехеровата чаша (4.1), в която предварително е бил поставен порцелановият диск за регулиране на кипенето (4.2). Добавят се 200 ml разтвор на калиева основа (3.4). Нагрява се до кипене и се оставя да се вари точно 30 min. Добавят се приблизително 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през свеж азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се мие с много гореща вода, докато промивната вода стане неутрална (изпитва се с лакмусова хартия), и след това три пъти с ацетон (3.6) (общо около 100 ml ацетон). Остатъкът се пренася количествено в тигел за изгаряне (4.5), като, ако е необходимо, се натрошава, и се суши до постоянно тегло в сушилния шкаф при 130°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Тигелът се поставя в муфелната пещ (4.6) и се накалява за 30 min при 900°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Празната проба се провежда, като се приложи същата процедура към обработения азбест (3.2), но без пробата. Загубата на тегло в резултат от накаляването на 6 g азбест не трябва да надвишава 10 mg. 6. Пресиятане на резултатите Съдържанието на грубо влакно като процент от пробата се дава от отношението: \frac{(a - b) 100}{3}, където: a е загубата на тегло след накаляване на пробата; b – загубата на тегло след накаляване на празната проба. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишават: 0,3 като абсолютна стойност, за съдържание на грубо влакно по-малко от 10%; 3% като относителна стойност, за съдържание на грубо влакно, равно или по-голямо от 10%. 7. Наблюдения 7.1. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи повече от 10% масла или мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с диетилов етер (3.7) преди анализа. За да се направи това, пробата (3 g, претеглена с точност до 1 mg) се поставя върху азбестов филтър (4.8). Залива се трикратно с около 50 ml диетилов етер и всеки път се филтрува внимателно под вакуум. Обезмаслената проба и азбестът се пренасят количествено в бехерова чаша (4.1) и анализът продължава, както е показано в (5). 7.2. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи масла и мазнини, които не могат директно да бъдат екстрахирани, трябва да бъдат обезмаслени, както е указано в 7.1, и допълнително обезмаслявани всеки път след измиване на киселината от остатъка при киселинната обработка. За да се направи това, киселината се измива от остатъка трикратно с ацетон (3.6) (общо 100 ml), след това трикратно с 50 ml диетилов етер (3.7). След това остатъкът се пренася количествено в бехерова чаша (4.1) и анализът се продължава, както е указано във втория абзац на т. 5 – обработка с разтвор на калиева основа). 7.3. Ако продуктите за изхранване на животни са богати на калций (повече от 2% калций), пробата за изследване (3 g, претеглени с точност до 1 mg) се поставя в бехерова чаша (4.1) със 100 ml 0,5 N солна киселина (3.5) и се оставя на хладно за 5 min. Филтрува се незабавно и се промива със студена вода. Като спомагателно средство за филтруване се използват 2 g от азбеста, указан за варенето със сярна киселина. Ако филтруването се окаже трудно, суспенсията се разрежда с ацетон (3.6). След това се процедира, както е указано в (5). XXXI. Определяне на нишесте чрез панкреатичен метод 1. Цел и област на приложение Методът дава възможност за определяне съдържанието на нишесте и на високомолекулните продукти от разграждане на нишестето в продуктите за изхранване на животни, съдържащи цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изрезки от сушена горна част на цвеклото или листа, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (напр. резанки и брашно от земна ябълка), и продукти, съдържащи пръжки. Определянията се провеждат само когато микроскопското изследване покаже, че в пробата има значителни количества нишесте. 2. Принцип Захарите, присъстващи в пробата, се екстрахират с етанол. Нишестето в екстрахирания остатък се разгражда до захар с панкреатин. Образуваните захари се хидролизират със солна киселина и получената глюкоза се определя по метода на Luff-Schoorl. Така полученото количество глюкоза, умножено по постоянен коефициент, дава съдържанието на нишесте в пробата. 3. Реактиви: 3.1. етанол, неутрален по фенолфталеин, 90% (о/о); 3.2. пентан-1-ол (амилов алкохол), ч.з.а; 3.3. толуол; 3.4. буферен разтвор: разтварят се във вода 9,078 g калиев дихидроген фосфат \text{KH}_2\text{PO}_4 и 11,876 g динатриев фосфат \text{Na}_2\text{HPO}_4 \cdot 2\text{H}_2\text{O}; обемът се долива до 1 l с вода; 3.5. разтвор на натриев хлорид, 0,2 N; 3.6. разтвор I на Carrez: разтварят се във вода 21,9 g цинков ацетат \text{Zn}(\text{CH}_3\text{COO})_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O} и 3 g ледена оцетна киселина; обемът се довежда до 100 ml с вода; 3.6. разтвор II на Carrez: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид \text{K}_4(\text{Fe}(\text{CN}_6)) \cdot 3\text{H}_2\text{O}; обемът се довежда до 100 ml с вода; 3.8. солна киселина, N; 3.9. солна киселина, ч.з.а, около 8 N, плътност 1,125; 3.10. разтвор на натриева основа, ч.з.а, около 10 N, плътност 1,33; 3.11. индикаторен разтвор на метилоранж, 0,1% (т/о); 3.12. панкреатин пулверизиран, както в указанията в т. 8; съхранява се в затворени бутилки, защитени от светлина и влага; 3.13. реактив на Luff-Schoorl. Разтворът на лимонена киселина (3.13.2) се налива в разтвора на натриев карбонат (3.13.3), като внимателно се разбърква по време на добавянето. След това се добавя разтворът на меден сулфат (3.13.1) и обемът се довежда до 1 l с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрува. Проверява се нормалността на така получения реагент (\text{Cu } 0,1 \text{ N}; \text{Na}_2\text{CO}_3 2 \text{ N}). pH на разтвора трябва да бъде около 9,4. 3.13.1. разтвор на меден сулфат: разтварят се 25 g меден сулфат, ч.з.а, \text{CuSO}_4 \cdot 5\text{H}_2\text{O} в 100 ml вода; 3.13.2. разтвор на лимонена киселина: разтварят се 50 g лимонена киселина, ч.з.а, \text{C}_6\text{H}_8\text{O}_7 \cdot 2\text{H}_2\text{O} в 50 ml вода; 3.13.3. разтвор на натриев карбонат: разтварят се 353,8 g безводен натриев карбонат, ч.з.а, в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади. 3.14. гранули пемза, пречистена чрез изваряване в солна киселина, промивани с вода и изсушавани; 3.15. разтвор на калиев йодид, ч.з.а, 30 % (т/о); 3.16. сярна киселина, около 6 N, плътност 1,18; 3.17. разтвор на натриев тиосулфат, 0,1 N; 3.18. разтвор на нишесте: Смес от 30 ml вода и 5 g разтворимо нишесте се прибавят към 1 l кипяща вода. Вари се 3 min и се оставя да се охлади. Този разтвор трябва да бъде свежо приготвен. 4. Апаратура: 4.1. екстрактор (виж фигурата на стр.12), състоящ се от: 4.1.1. широкогърлена конична колба от 500 ml; 4.1.2. обратен хладник, комплектуван с кран към коничната колба; 4.1.3. подвижно вретено в центъра на обратния хладник с кука в долния край; щипка за закрепване на вретеното; 4.1.4. метален съд, който се закачва за куката на вретеното (4.1.3) и държи филтрационния тигел (4.1.5); 4.1.5. филтрационен тигел за бързо филтруване с максимален размер на порите от 90 до 100\mu (напр. порьозност 1), с капацитет около 30 ml; 4.1.6. филтърни хартии, подходящи по размер за филтрационния тигел; 4.2. термостат, регулиран на 38°C; 4.3. мерителни колби от 200 ml със стандартен шлиф и обратен хладник; 4.4. мерителни колби от 100 ml със стандартен шлиф и обратен хладник. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се раздробява така, че цялата да мине през сито 0,5 mm (отговаря на сито ISO R 565). 5.2. Екстракция Претегля се 2 g проба с точност до 1 mg и се пренася във филтрационния тигел (4.1.5), дъното на който е било предварително покрито с филтърна хартия (4.1.6), напоена с етанол (3.1). В коничната колба (4.1.1) се поставят 55 mm етанол (3.1) и няколко гранули пемза (3.14). Филтрационният тигел се поставя в металния съд (4.1.4) и последният се окачва на куката на вретеното (4.1.3). Обратният хладник се поставя на коничната колба и вретеното се спуска надолу така, че дъното на тигела да докосва точно повърхността на етанола. Вретеното се фиксира здраво на това ниво. Етанолът се довежда до кипене и се вари 3 h. След това се оставя да се охлади и вретеното (4.1.3) се издърпва така, че да повдигне тигела колкото е възможно по-високо в коничната колба. Коничната колба се отваря внимателно и по стената на колбата се добавят 45 ml вода. Обратният хладник се поставя обратно на ерленмайеровата колба и филтрационният тигел се фиксира на 10 cm над повърхността на течността. Течността се довежда до кипене и се вари 3 h. След това колбата се охлажда, отваря се и тигелът се изважда от съда. 5.3. Озахаряване и хидролиза Тигелът се поставя на смукателно шише и се изсушава при изсмукване. Остатъкът от екстракцията се пренася в хаван и се стрива фино. Прахът се пренася количествено с около 60 ml вода в мерителна колба от 200 ml, снабдена със стандартен шлиф, и се добавят няколко капки амилов алкохол (3.2). Колбата се свързва с обратен хладник. Нагрява се до кипене и се вари 1 h, след което се оставя да се охлади и обратният хладник се сваля. Добавят се 25 ml буферен разтвор (3.4), 250 mg панкреатин (3.12), 2,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 10 капки толуол (3.3). Разклаща се 2 min, колбата се поставя в термостата (4.2) и се държи там 21 h, като от време на време се разклаща. След това се оставя да се охлади до стайна температура. Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.6) и се разклаща 1 min. След това се добавят 5 ml разтвор II на Carrez (3.7) и отново се разклаща за 1 min. Обемът се допълва с вода, смесва се и се филтрува. 50 ml от филтрата се пренасят с пипета в мерителна колба от 100 ml (може да се работи също със 100 ml филтрат и мерителна колба от 200 ml). Добавят се няколко капки от индикатора (3.11) и се подкислява с 8 N солна киселина (3.9), докато индикаторът се оцвети червено. След това се добавят допълнително 6,25 ml 8 N солна киселина (3.9) (или 12,50 ml, ако се работи със 100 ml филтрат). Съединява се обратният хладник към колбата, разтворът се довежда до кипене и се вари 1 h. Оставя се да се охлади, неутрализира се с 10 N разтвор на натриева основа (3.10), докато индикаторът се оцвети в жълто. След това се подкислява леко чрез добавяне на малко солна киселина, N (3.8). Обемът се допълва с вода и се смесва. Съдържанието на глюкоза се определя съгласно метода на Luff-Schoorl, както е указано в т. 5.4. 5.4. Титруване по Luff-Schoorl. В ерленмайерова колба от 300 ml се пренасят с пипета 25 ml от реактива на Luff-Schoorl и точно премерени 25 ml от разтвора, получен в т. 5.3, който не би трябвало да съдържа повече от 60 mg глюкоза. Добавят се 2 гранули пемза (3.14). При разклащане на ръка се нагрява над среден пламък и течността се довежда до кипене за около 2 min. Коничната колба незабавно се поставя върху телена мрежа с азбестово покритие, която има отвор с диаметър около 6 cm. Пламъкът под телената мрежа е запален и регулиран предварително така, че да се нагрява само дъното на коничната колба. След това се свързва обратният хладник към коничната колба. Веднага щом това е направено, се вари точно 10 min. Охлажда се незабавно в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.15) и незабавно след него, но внимателно (поради опасност от силно запенване) 25 ml 6 N сярна киселина (3.16). След това се титрува с разтвор на 0,1 N натриев тиосулфат (3.17), докато се появи убито жълто оцветяване, добавят се няколко капки разтвор на нишестен индикатор (3.18) и титруването се довършва. Същото титруване се провежда и на точно измерена смес от 25 ml на реагента на Luff-Schoorl (3.13) и 25 ml вода след добавяне към нея на 10 ml разтвор на калиев йодид и 25 ml 6 N сярна киселина (3.16), но без да се кипи. 5.5. Празна проба Празната проба се провежда, като се прилага процедурата, описана в т. 5.3 и 5.4, но без проба за анализиране. 6. Пресмятане на резултатите Като се използва таблицата в приложението, се определя количеството глюкоза в mg, отговарящо на разликите в резултатите от двете титрувания (изразени като ml 0,1 N натриев тиосулфат) и отнасящи се както до пробата за анализ, така и до празната проба. Съдържанието на нишесте, като процент от пробата, се дава от формулата: 0,72 (A – B), където: A е глюкозата, отнасяща се до пробата за анализ, в mg; B – глюкозата, отнасяща се до празната проба (виж наблюдение 7.2), в mg. 7. Наблюдения 7.1. Когато в пробата присъстват едновременно лактоза и частично или напълно разградено до декстрин нишесте, резултатът може да бъде завишен с 0,5 до 3%. В такива случаи действителното съдържание на нишесте се получава, както следва: a) определя се съдържанието на редуциращи захари в етаноловия екстракт, получен в т. 5.2 и резултатът се изразява като процент глюкоза; b) определя се съдържанието на водоразтворими редуциращи захари в пробата и резултатът се изразява като процент глюкоза; v) резултатът, получен в (a), се изважда от този, получен в (b), и разликата се умножава по 0,9; g) стойността, получена във (v), се изважда от съдържанието на нишесте, получено чрез прилагане на метода и пресмятането по т. 6. 7.2. Количеството глюкоза, отнасящо се до празната проба, нормално е 0,25 mg. То не може да бъде по-голямо от 0,50 mg. 8. Указания, отнасящи се за панкреатина: външен вид; жълтеникавобял аморфен прах; съдържание на глюкоза – количеството на глюкоза в празната проба (виж 5.5) нормално е 0,25 mg. Резултат, по-голям от 0,50 mg, показва, че панкреатинът не може повече да бъде използван. Проверка за свързване на йод: Суспендират се 62,5 mg панкреатин в около 50 ml вода, нагрята до около 25 – 30°C. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Разбърква се 2 min. Титрува се с 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат в присъствие на нишестен индикатор. Свързването на йодния разтвор от панкреатина не трябва да надвишава 0,5 ml. Проверка за амилолитична активност. Смесват се 100 ml разтвор на нишесте (3.18), 5 ml буферен разтвор (3.4), 0,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 62,5 mg панкреатин. Сместа се нагрява до 25 – 30°C и се разбърква за 2 min. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Синьото оцветяване от добавянето на разтвора на йод трябва да изчезне в продължение на не повече от 15 min. Таблица на значенията за 25 ml реактив на Luff-Schoorl ml 0,1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6 Глюкоза, фруктоза, инвертни захари Лактоза Малтоза 0,1 N \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_6 mg разлика mg разлика C6H12O6 Mr Ml mg разлика mg разлика Mr разлика Ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 3,1 80,0 4,1 94,6 4,6 23 XXXII. Определяне на ампролиум 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на ампролиум в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване 1 mg/kg, границата на определяне 25 mg/kg. 2. Принцип Пробата се извлича със смес метанол - вода. След разтваряне с мобилната фаза и мембранна филтрация, съдържанието на ампролиум се определя с помощта на висококачествена течна хроматография катионен обмен (HPLC), използваща УВ детектор. 3. Реагенти: 3.1. метанол; 3.2. ацетонитрил, клас HPLC; 3.3. вода, клас HPLC; 3.4. разтвор на натриев двуводороден фосфат, c = 0,1 \text{ mol/l} – разтварят се 13,80 g монохидрат на натриев двуводороден фосфат във вода (3.3) в мерителна колба 1000 ml, долива се до отметката вода (3.3) и се смесва; 3.5. разтвор на натриев перхлорат, c = 1,6 \text{ mol/l} – разтварят се 224,74 g монохидрат на натриев перхлорат във вода (3) в мерителна колба 1000 ml и се долива до отметката вода (3) и се смесва; 3.6. мобилна фаза за HPLC (виж забележка 9.1) – смес на ацетонитрил (3.2), разтвор на натриев двуводороден фосфат (3.4) и разтвор на натриев перхлорат (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v), преди употреба се филтрира през мембранен филтър 0,22 \mu\text{m} (4.3) и се дегазира разтворът (напр. в ултразвукова вана (4.4) най-малко 15 min); 3.7. еталонен разтвор: чист ампролиум, 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид, E 750 (виж 9.2); 3.7.1. изходен еталонен разтвор на ампролиум 500 \mu\text{g/ml} – претеглят се с точност 0,1 mg 50 mg ампролиум (3.7) в мерителна колба 100 ml, разтварят се в 80 ml метанол (3.1) и колбата се поставя за 10 min в ултразвукова вана (4.4); след ултразвуковата обработка разтворът се довежда до стайна температура, долива се вода до отметката и се смесва; при температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец; 3.7.2. междинен еталонен разтвор на ампролиум, 50 \mu\text{g/ml} – 5 ml от изходния еталонен разтвор (3.7.1) се пипетират в мерителна колба 50 ml, допълва се до отметката с екстракционния разтворител (3.8) и се смесва. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец; 3.7.3. калибриращи разтвори – прехвърлят се 0,5; 1 и 2 ml от междинния еталонен разтвор (3.7.2) в няколко мерителни колби 50 ml. Допълват се до отметката с мобилна фаза (3.6) и се смесва. Тези разтвори съответстват 0,5; 1 и 2 \mu\text{g} ампролиум на ml. Те се приготвят непосредствено преди употреба; 3.8. екстракционен разтворител – смес метанол (3.1)-вода 2 + 1 (v + v). 4. Апарати: 4.1. оборудване HPLC с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 100 \mu\text{l}; 4.1.1. течна хроматографска колона 125 mm \times 4 mm, катионен обмен, пълнеж Nucleosil 10 SA, 10 \mu\text{m} или еквивалентен; 4.1.2. УВ детектор с регулиране дължината на вълната или диоден полеви детектор; 4.2. мембранен филтър, материал PTFE, 0,45 \mu\text{m}; 4.3. мембранен филтър, 0,22 \mu\text{m}; 4.4. ултразвукова вана; 4.5. механичен вибратор или магнитна бъркалка. 5. Процедура 5.1. Общи положения 5.1.1. Празна проба храна За осъществяване на теста на възстановяване (5.1.2) трябва да се анализира празна проба храна, за да се провери отсъствието на ампролиум и на субстанции, които оказват влияние. Празната проба храна трябва да бъде подобна по вид на пробата и ампролиум или субстанциите, които оказват въздействие. 5.1.2. Тест за възстановяване Трябва да се извърши тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било добавено количество ампролиум, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 100 mg/kg, 10 ml от изходния еталонен разтвор (3.7.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба 250 ml и разтворът се изпарява до около 0,5 ml. Прибавят се 50 g от празната проба храна, разбърква се добре и се оставя за 10 min, като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2). Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът на възстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да се анализира, се подсилва с количество ампролиум, подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба се анализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане. 5.2. Екстракция 5.2.1. Предварително приготвени смеси (съдържание < 1\% ампролиум) и животински храни С точност до 0,01 g се претеглят 5 до 50 g от пробата в зависимост от съдържанието на ампролиум в ерленмайерова колба 500 ml, прибавят се 200 ml екстракционен разтвор (3.8). Колбата се поставя за 15 min в ултразвукова вана (4.4). Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с вибратора или бъркалката (4.5) в продължение на 1 h. Аликватът на екстракта се разрежда с мобилната фаза (3.6) до съдържание на ампролиум от 0,5 до 2 \mu\text{g/ml} и се смесва (виж забележка 9.3) 5 до 10 ml от този разреден разтвор се филтрират през мембранен филтър (4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3). 5.2.2. Предварително приготвени смеси (съдържание \geq 1\% ампролиум) С точност до 0,001 g се претеглят 1 до 4 g от предварително приготвената смес в зависимост от съдържанието на ампролиум в ерленмайерова колба 500 ml, прибавят се 200 ml екстракционен разтвор (3.8). Колбата се поставя за 15 min в ултразвукова вана (4.4). Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с вибратора или бъркалката (4.5) в продължение на 1 h. Аликватът на екстракта се разрежда с мобилната фаза (3.6) до съдържание на ампролиум от 0,5 до 2 µg/ml и се смесва (виж забележка 9.3). 5 до 10 ml от този разреден разтвор се филтрират през мембранен филтър (4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3). 5.3. Определяне с HPLC 5.3.1. Параметри – следните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако те дават еквивалентни резултати. Течно-хроматографска колона(4.1.1): Nucleosil 10 125 mm × 4 mm катионно – обменен пълнеж SA, 10 µm или еквивалентен Подвижна фаза смес от ацетонитрил, натриев дихидроген фосфатен разтвор (3.4) и разтвор от натриев перхлорат(3.5), 450+450+100( v+v+v) скорост на изтичане дължина на вълната: инжекционен обем 0,7 за 1ml/min 264 nm 100 µl Необходимо е да се провери стабилността на хроматографската система, като се инжектира няколко пъти калибриращият разтвор (3.7.3), съдържащ 1,0 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне. 5.3.2. Калибрираща графика Няколко пъти се инжектира калибриращ разтвор (3.7.3) и се определят средноаритметичните височини (площ) на пиковете за всяка концентрация. Начертават се калибриращата графика, като се използват средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответните концентрации в µg/ml за абсциси. 5.3.3. Разтвор на пробата Екстракт от пробата се инжектира (5.2) няколко пъти, като се използва същият обем като приетия за калибриращите разтвори и се определят средноаритметичните височини (площ) на пиковете на ампролиум. 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площ) на пиковете на ампролиум на разтвора се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието на ампролиум w в mg/kg в пробата се дава със следната формула: w = \frac{V.b.f}{m} [mg/kg], където: V е обемът на екстракционния разтворител (3.8) в ml в съответствие с т. 5.2 (т.е. 200 ml); b – концентрацията на ампролиум в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml; f – коефициент на разреждане съгласно т. 5.2; m – масата на изпитваната част в g (5.2). 7. Установяване на достоверността на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2) и на калибриращия разтвор (3.7.3), съдържащ 2,0 µg/ml. 7.1.1. Ко-хроматография Екстракт на пробата се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3.7.3). Количеството на добавения ампролиум трябва да бъде подобно на количеството ампролиум, открито в екстракта на пробата. Само височината на пика на ампролиум трябва да се увеличи, след като се вземат предвид както добавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика, по средата на неговата височина, трябва да бъде в рамките на \pm 10\% от оригиналната широчина на пика на ампролиум на неподсилен екстракт на разтвора. 7.1.2. Диодна полева детекция Резултатите се оценяват съгласно следните критерии: (а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена от разрешаващата способност на системата за детекция. За диодната детекция типично тя е в рамките на \pm 2 nm; (б) между 210 и 320 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика на хроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 %, от относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра на еталонния аналит; (в) между 210 и 320 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика, произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра във връхната точка на пика. Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава: 15 % от най-високия резултат – за съдържание на ампролиум между 25 mg/kg и 500 mg/kg; 75 mg/kg съдържание на ампролиум между 500 mg/kg и 500 mg/kg; 7,5 % от най-високия резултат – за съдържание на ампролиум над 1000 mg/kg. 7.3. Възстановяване За една подсилена празна проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от съвместното изследване При провеждане на изследване и анализиране на три мостри храни за птици (проби 1 – 3), една минерална храна (проба 4) и предварително приготвена смес (проба 5) се постигат следните резултати: Проба1 Проба2 Проба3 Проба4 Проба5 L 14 14 14 14 15 n 56 56 56 56 60 Mean [mg/kg] - 45=5 188 5129 25 140 SR - 2,26 3,57 178 550 CVR[%] - 4,95 1,90 3,46 2,20 sf: - 2,95 11,8 266 760 CVf[%]: - 6,47 6,27 5,19 3,00 Номинално съдържание [mg/kg] - 50 200 5000 25 000 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; sf: – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVf: – коефициент на вариации на възпроизводимост. 9. Забележки 9.1. Ако пробата съдържа тиамин, пикът на тиамина на хроматограмата се появява малко преди пика на ампролиум. Като се следва този метод, ампролиумът и тиаминът трябва да се разделят. Ако тиаминът и ампролиумът не се разделят с помощта на колона (4.1.1), използвана при този метод, до 50% от ацетонитрилната част на мобилната фаза се заменя (3.6) с метанол. 9.2. Съгласно британската фармакопея спектър на разтвор на ампролиум (c = 0,02 mol/l) показва максимуми при 246 nm и 262 nm. Абсорбцията ще възлезе на 0,84 при 246 nm и 0,80 при 262 nm. 9.3. Екстрактът трябва винаги да бъде разреден с мобилна фаза, защото иначе времето на забавяне на пика на ампролиума може значително да се премести поради промени в йонната сила. XXXIII. Определяне на етопабат (метил-4-ацетамидо-2-етоксибензоат) 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на етопабат в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 2 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с разреден метанол. Разтворът се подкислява и екстрахира с хлороформ. Хлороформният екстракт се промива първо с алкален разтвор и след това с вода. Пречистеният екстракт се концентрира, етопабатът се хидролизира с разредена солна киселина. Образуваното по този начин аминопроизводно се диазотира и куплира с 2-аминоетил-1-нафтиламин. Цветният комплекс се екстрахира с бутанол и оптическата плътност на разтвора се измерва при 555 nm. 3. Реактиви: 3.1. метанол, ч.з.а; 3.2. метанол, 50% (о/о) – смесват се еднакви обеми метанол (3.1) и вода; 3.3. солна киселина, ч.з.а, плътност 1,19; 3.4. солна киселина, разредена 1 : 10 – 10,0 ml солна киселина (3.3) се разрежда с вода до 100 ml; 3.5. солна киселина, около 0,3 N – разреждат се 25 ml солна киселина (3.3) до 1000 ml с вода; 3.6. хлороформ, ч.з.а; 3.7. разтвор на натриев карбонат, 4% (т/о) – разтварят се 40 g безводен натриев карбонат, ч.з.а, във вода и разтворът се довежда до 1000 ml с вода; 3.8. разтвор на натриев нитрит, 0,2% (т/о) – разтварят се във вода 100 mg натриев нитрит, ч.з.а., и обемът се довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се непосредствено преди употреба; 3.9. разтвор на амониев сулфамат, 1,0% (т/о) – разтварят се във вода 500 mg амониев сулфамат, ч.з.а., и обемът се довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се непосредствено преди употреба; 3.10. разтвор на 2-аминоетил-1-нафтиламин, 0,2% (т/о) – разтварят се във вода 100 mg 2-аминоетил-1-нафтиламин, ч.з.а., и обемът се довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се непосредствено преди употреба; 3.11. безводен натриев хлорид, ч.з.а; 3.12. n-бутанол, ч.з.а; 3.13. стандартна субстанция – чист етопабат; 3.14. стандартни разтвори: 3.14.1. разтвор на етопабат 0,040 mg/ml – претеглят се с точност 0,1 mg 40 mg от стандартната субстанция (3.13); разтварят се в метанол (3.2) в мерителна колба от 100 ml, обемът се допълва със същия разтворител и се смесва; разреждат се с метанол (3.2) 10,0 ml от този разтвор до 100 ml в мерителна колба; полученият разтвор е стабилен в течение на един месец; 3.14.2. разтвор на етопабат 0,016 mg в 20 ml – в мерителна колба от 250 ml се разреждат с метанол (3.2) 5 ml от разтвора (3.14.1) и се смесват добре; приготвя се преди употреба. 4. Апаратура: 4.1. конични колби от 250 ml с шлифови запушалки; 4.2. делителни фунии от 100 ml с шлифови запушалки; 4.3. клатачна машина; 4.4. ротационен вакуум изпарител с колби от 250 ml; 4.5. водна баня; 4.6. центрофуга с епруветки от 50 и 15 ml с шлифови запушалки; 4.7. въздушен хладник с шлифова свръзка; 4.8. спектрофотометър с кювети от 10 mm. 5. Процедура 5.1. Екстракция Количество от фино раздробена и хомогенизирана проба, съдържаща около 80 mg етопабат, се претегля с точност до 1 mg. Изследваната порция се пренася в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят 100,0 ml разреден метанол (3.2). Колбите се запушват и се разклащат един час на клатачката (4.3). Декантира се, филтрува се и първите милилитри от филтрата се отстраняват. 5.2. Пречистване Забележка: Всички операции по тази точка трябва да бъдат проведени бързо. Пренасят се 20 ml от бистрия екстракт в делителна фуния от 100 ml (4.2), добавят се 5 ml от разредената 1:10 солна киселина (3.4) и 20 ml хлороформ (3.6). Отначало се разклаща внимателно, а после енергично за 3 min. Оставя се, докато се разделят зоните и фазата на хлороформа се събира във втора делителна фуния от 100 ml (4.2). Киселата фаза се екстрахира още два пъти с по 20 ml хлороформ (3.6). Хлороформените екстракти се събират във втората делителна фуния, а киселата фаза се изхвърля. Към комбинирания хлороформен разтвор се добавят 10 ml разтвор на натриев карбонат (3.7), разклаща се 3 min и се оставя фазите да се разделят. Фазата на хлороформа се събира в трета делителна фуния (4.2), а водната фаза се изхвърля. Към хлороформения разтвор се добавят 10 ml разтвор на натриев карбонат (3.7), разклаща се 3min и се оставя фазите да се разделят. Фазата на хлороформа се събира в четвърта делителна фуния от 100 ml (4.2), промива се двукратно с по 25 ml вода, водните фази се отделят, а хлороформеният екстракт се събира количествено в колба от 250 ml (4.4). Водните фази се събират в една от делителните фунии; всяка делителна фуния се промива с няколко милилитра хлороформ, водната фаза се екстрахира със същите милилитри хлороформ, оставя се фазите да се разделят и фазата на хлороформа се добавя към хлороформения екстракт в колбата. 5.3. Хидролиза С помощта на ротационния вакуум изпарител (4.4) хлороформеният екстракт се изпарява до около 2 ml на водна баня при температура 50° С. Остатъкът се разтваря в 2 – 3 ml метанол (3.1) и разтворът се пренася количествено в центрофужна епруветка от 50 ml с помощта на две порции от по 10 ml и една порция от 5 ml 0,3 N солна киселина (3.5). Съединява се въздушният хладник (4.7), добавят се няколко парченца стъкло, разклаща се добре, епруветката се потопява в кипяща водна баня и се държи там 45 min. След това се охлажда на струя студена течаща вода. 5.4. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност Добавя се 1,0 ml разтвор на натриев нитрит (3.8), разбърква се и се оставя да престои 2 min. Добавя се 1,0 ml разтвор на натриев сулфамат (3.9), разклаща се и се оставя да престои 2 min. Добавя се 1,0 ml разтвор на 2-аминоетил-1-нафтиламин (3.10), разклаща се и се оставя да престои 10 минути. Добавят се 0,5 g натриев хлорид (3.11) и 10,0 ml n-бутанол (3.12), разклаща се енергично, докато натриевият хлорид се разтвори напълно. Супернатантният бутанолов разтвор се изтегля с пипета, пренася се в центрофужна епруветка от 15 ml (4.6) и се центрофугира. Оптическата плътност (EA) се измерва на спектрофотометър при 555 nm срещу n-бутанол (3.12). 5.5. Контролен тест Контролният тест се провежда с 20 ml метанол (3.2) по същата процедура, като се започне от т. 5.2. Оптическата плътност (EB) се измерва при 555 nm срещу n-бутанол (3.12). 5.6. Стандартен тест Стандартният тест се провежда с 20 ml стандартен разтвор (3.14.2) по същата процедура, като се започне от т. 5.2. Оптическата плътност (EC) се измерва при 555 nm срещу n-бутанол (3.12). 6. Пресмятане на резултати Съдържанието на етопабат в mg на килограм проба се дава от формулата: (EA - EB) / (EC - EB) \cdot 80/W, където: EA е оптическата плътност на разтвора от пробата; EB – оптическа плътност на разтвора от контролния тест; EC – оптическа плътност на разтвора от стандартния тест; W – теглото на порцията за изследване в грамове. 7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 20%, като относителна стойност – за съдържание на етопабат под 7,5 ppm; • 1,5 ppm, като абсолютна стойност, за съдържание между 7,7 и 10 ppm; • 15%, като относителна стойност, за съдържание над 10 ppm. XXXIV. Определяне на динитолмид (ДОТ) (3,5-динитро-о-толуамид) 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на динитолмид (ДОТ) в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Нитрофуранови производни могат да пречат. Долната граница на определянето е 40 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с ацетонитрил. Екстрактът се пречиства върху алуминиев окис и се филтрува. Аликвота от филтрата се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря в диметилформамид и се обработва с етилендиамин, с който образува пурпурен комплекс. Динитолмидът се определя спектрофотометрично при 560 nm. 3. Реактиви: 3.1. Ацетонитрил, 85 % (о/о) – смесват се 850 ml чист ацетонитрил и 150 ml вода. Сместа се дестилира преди употреба, като се събира фракцията, която кипи между 75 и 77 °C. 3.2. Алуминиев окис за колонна хроматография – накалява се при 750°C най-малко два часа, охлажда се в ексикатор и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло с шлифова запушалка. Преди употреба се навлажнява, както следва: в бутилка от кафяво стъкло се поставят 10 g алуминиев окис и 0,7 ml вода, бутилката се запушва, нагрява се 5 min на кипяща водна баня, като енергично се разклаща, оставя се да се охлади, като разклащането се продължава; активността се проверява, като се подлага на анализ, започвайки от т. 5.1, определено количество от стандартния разтвор (3.6). Добивът от динитолмид трябва да бъде 100±2%. 3.3. N,N-диметилформамид, 95% (о/о) – смесват се 95 ml N,N-диметилформамид, ч.з.а., и 5,0 ml вода; 3.4. Диаминоетан, ч.з.а., с максимално водно съдържание 2%. 3.5. Стандартна субстанция – чист 3,5-динитро-о-толуамид, отговарящ на следната характеристика: точка на топене: 177°C; молекулярен екстинкционен коефициент при 248 nm в ацетонитрил – 13,1 при 10,3; молекулярен екстинкционен коефициент при 266 nm в N,N-диметилформамид – 10,1 при 10,3. 3.6. Стандартен разтвор – претеглят се с точност до 0,1 mg 40 mg от стандартната субстанция (3.5) и се разтварят с ацетонитрил (3.1) в мерителна колба от 200 ml. Обемът се допълва със същия разтворител и се смесва. 20 ml се разреждат до 100 ml с ацетонитрил (3.1) в мерителна колба и се смесват. 1 ml от този разтвор съдържа 40 mg динитолмид. 4. Апаратура: 4.1. конична колба от 250 ml с шлифова запушалка; 4.2. обратен хладник с шлифова свръзка; 4.3. шот-филтър G3 с диаметър 60 mm; 4.4. вакуумфилтър (такъв като апарат на Witt); 4.5. водна баня, регулирана на 50°C; 4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm. 5. Процедура 5.1. Екстракция и пречистване 10 g фино раздробена и хомогенизирана проба се претеглят с точност до 1 mg. За концентрати и премикси се претеглят 1 g с точност 1 mg. Порцията за изследване се поставя в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят 65 ml ацетонитрил (3.1). Смесва се, монтира се обратният хладник (4.2) към колбата и се нагрява на водна баня (4.5) за 30 min, като непрекъснато се разклаща. Охлажда се под струя студена вода. Добавят се 20 g алуминиев окис (3.2), охлажда се 3 min и се оставя да се утаи. Мерителна колба от 100 ml се поставя във филтрувалния апарат (4.4), закрепва се шотфилтърът (4.3) и разтворът се филтрува при изсмукване. Неразтворените остатъци в колбата се пренасят във филтъра с няколко ml ацетонитрил (3.1) и се изсмуква до сухо. Вакуумът се освобождава. Остатъкът върху филтъра се ресуспендира в няколко ml ацетонитрил (3.1) и се филтрува отново. Тази операция се повтаря, докато обемът на филтрата достигне до около 95 ml. Долива се до 100 ml с ацетонитрил (3.1) и се смесва. Ако е необходимо, аликвотът се разрежда с ацетонитрил (3.1) така, че да се получи разтвор, съдържащ от 5 до 15 mg динитолмид на 1 ml. 5.2. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност В три бехерови чаши от 50 ml, съответно A, B и V, се пипетират по 4 ml от разтвора, получен в т. 5.1. Само в чаша B се добавя 1 ml от стандартния разтвор (3.6). Трите чаши се поставят на водна баня (4.5) в камина с добра вентилация и се изпаряват до сухо в поток на сух въздух. Трите чаши се охлаждат при стайна температура. В чаша A се добавят 10 ml N,N-диметилформамид (3.3) и по 2 ml в чашите B и V. Оставят се за няколко минути, като се разбъркват по малко, докато остатъкът се разтвори напълно. След това в чашите B и V се добавя по 8 ml диаминоетан (3.4) и се разбърква. Точно 5 min след добавянето на диаминоетана оптическата плътност на трите разтвора се измерва на спектрофотометър (4.6) при 560 nm срещу N,N-диметилформамид (3.3). 6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на динитолмид в mg/kg проба се получава по формулата: (EB - EA) / (EC - EB) * F / W * 1000, където: EA е оптическата плътност на разтвор A (празна проба); EB – оптическата плътност на разтвор B (проба за анализиране); EC – оптическата плътност на разтвор C (вътрешен стандарт); W – теглото на порцията за изследване в грамове; F – коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1). 7. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишават: • 10 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание на динитолмид под 100 ppm; • 10%, като относителна стойност – за съдържание между 100 и 5000 ppm; • 500 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 5000 и 10 000 ppm; • 5%, като относителна стойност – за съдържание над 10 000 ppm. XXXV. Определяне на никарбазин (еквимолекулярна смес от 4,4'-динитрокарбанилид и 2-хидрокси-4,6-диметилпиримидин) 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на никарбазин в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, съдържащи не повече от 5% тревно брашно. Нитрофуранови производни, ацетиленхептин и карбадокс могат да пречат. Долната граница на определянето е 20 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с N,N-диметилформамид. Екстрактът се пречиства чрез хроматография на колона с алуминиев окис; никарбазинът се елюира с етанол. Елюатът се обработва с разтвор на натриева основа в етанол, при което се развива жълто оцветяване. Никарбазинът се определя спектрофотометрично при 430 nm. 3. Реактиви: 3.1. N,N-диметилформамид, ч.з.а.; 3.2. алуминиев окис за колонна хроматография – накалява се при 750°C най-малко за 2 h, охлажда се в ексикатор и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло с шлифова запушалка; преди използване активността се проверява, като се подлага на анализ, започвайки се от т. 5.2, определено количество от стандартния разтвор (3.8.3); добивът от никарбазин трябва да бъде 100 \pm 2\%. 3.3. етанол, ч.з.а., 95% (о/о); 3.4. етанол, ч.з.а., 80% (о/о); 3.5. разтвор на натриева основа, ч.з.а., 50% (т/о); 3.6. разтвор на натриева основа в етанол, 1% (т/о) – в мерителна колба от 50 ml се поставят 1 ml от разтвора на натриева основа (3.5) и обемът се допълва с 80%-ен етанол (3.4). Приготвя се по време на употреба. 3.7. стандартна субстанция: чист никарбазин; молекулярен екстинкционен коефициент при 362 nm N,N-диметилформамид: 37,8 при 10,3; 3.8. стандартни разтвори: 3.8.1. разтвор на никарбазин, 1,25 mg/ml – претеглят се с точност до 0,1 mg 125 mg от стандартната субстанция (3.7); разтварят се в 75 ml в N,N-диметилформамид (3.1) в мерителна колба от 100 ml, подгрява се леко, оставя се да се охлади, обемът се допълва със същия разтворител и се смесва; пази се далеч от светлина. 3.8.2. разтвор на никарбазин, 0,125 mg/ml – 10 ml от разтвор (3.8.1) се разреждат с N,N-диметилформамид (3.1) до 100 ml в мерителна колба и се смесва; 3.8.3. разтвор на никарбазин, 0,025 mg/ml – 20 ml от разтвор (3.8.2) се разреждат с N,N-диметилформамид (3.1) до 100 ml в мерителна колба и се смесва. 4. Апаратура: 4.1. конична колба от 250 ml с шлифова запушалка; 4.2. обратен хладник с шлифова свръзка; 4.3. кипяща водна баня; 4.4. центрофуга с епруветки от 120 ml; 4.5. стъклена колона за хроматография (вътрешен диаметър 25 mm, дължина 300 mm); 4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm; 4.7. бюрета, градуирана на 1/10 ml. 5. Процедура 5.1. Екстракция 10 g фино раздробена и хомогенизирана проба се претеглят с точност до 1 mg. За концентрати и премикси се претеглят 1 g с точност 1 mg. Порцията за изследване се поставя в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят точно 100 ml N,N-диметилформамид (3.1). Смесва се, монтира се обратният хладник (4.2) към колбата и се нагрява на водна баня (4.3) за 15 min, като се разклаща от време на време. Охлажда се под струя студена вода. След това в центрофужна епруветка (4.4) се излива супернатантният слой и се центрофугира около 3 min. Ако е необходимо, 25 ml от супернатантния слой се разреждат с N,N-диметилформамид (3.1), за да се получи разтвор, съдържащ от 2 до 10 mg никарбазин. 5.2. Хроматография В колоната за хроматографиране (4.5) се налива суспенсия от 30 g алуминиев окис (3.2) в N,N-диметилформамид (3.1). Нивото на течността се оставя да спадне до 1 cm над алуминиевия окис, след което в колоната се наливат 25 ml от екстракта, получен в т. 5.1. Течността се оставя да изтича и, като не се позволява на колоната да изсъхне, тя се промива с три порции от по 10 ml N,N-диметилформамид (3.1). След това се елюира със 70 ml 95%-ен етанол (3.3). Първите 10 ml от елюата се елиминират, а остатъкът се разделя, както следва: една порция от 5 ml (а); една порция от 50 ml в мерителна колба (б); една порция от 5 ml (в). Проверява се дали порциите (а) и (в) не се оцветяват жълто, когато се добави етанолов разтвор на натриева основа (3.6). Операциите продължават с порция (б), както е указано в т. 5.3. 5.3. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност В две отделни мерителни колбички от 25 ml, A и Б, се пипетират по 20 ml от порция (в) на елюата. В колба A се добавят 5 ml от етаноловия разтвор на натриева основа (3.6), а в колба Б – 5 ml 95%-ен етанол (3.3). Смесва се добре. Оптическата плътност на двата разтвора се измерва в следващите 5 min при 430 nm срещу смес от 20 ml 95%-ен етанол (3.3) и 5,0 ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6). Изважда се стойността на оптическата плътност на разтвор Б от тази на разтвор А. От тази стойност се определя количеството никарбазин чрез сравняване с калибровъчна крива 5.4. 5.4. Калибровка 25 ml от стандартния разтвор (3.8.3) се подлагат на хроматографиране, както е указано в т. 5.2. Порция (б) на елюата се налива в градуирана бюрета (4.7) и разпределя в мерителни колби от 25 ml в обеми, както следва: 2; 4; 6; 8 и 10 ml (отговарящи съответно на 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 и 0,125 mg никарбазин). Във всяка колба се добавят 5 ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6), обемите се допълват с 95%-ен етанол (3.3) и се смесват добре. Оптическата плътност на разтворите се измерва в следващите 5 min при 430 nm срещу смес от 20 ml 95%-ен етанол (3.3) и 5 ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6). Калибровъчната крива се построява, като се нанасят значенията за оптическата плътност по ординатата, а съответните количества никарбазин в mg – по абсцисата. 6. Пресмятане на резултати Съдържанието на никарбазин в mg на килограм проба се дава от формулата: A/W*F* 10 000 , където: А е количеството никарбазин в mg, както е определено при фотометричното измерване; W – теглото на порцията за изследване в грамове; F – коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1). 7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 10 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание на никарбазин по-малко от 100 ppm; • 10% като относителна стойност – за съдържание между 100 и 5000 ppm; • 500 ppm като абсолютна стойност – за съдържание между 5000 и 10 000 ppm; • 5% като относителна стойност – за съдържание над 10 000 ppm. XXXVI. Определяне на менадион (витамин K3) 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне количеството на менадион (витамин K3) в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 1 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с разреден етанол. Сместа се избистря с разтвор на танин и се центрофугира. Екстрактът се обаботва с разтвор на натриев карбонат; освободеният менадион се екстрахира с 1,2-дихлоретан. В зависимост от съдържанието на менадион дихлоретановият екстракт се обработва или директно, или след изпаряване. Обработването се извършва с 2,4-динитрофенилхидразин в етанол, подкислен със солна киселина. Полученият хидразон, обработен с излишък от амоняк, образува синьозелено оцветен комплекс, чиято оптическа плътност се измерва при 635 nm. 3. Реактиви: 3.1. етанол, 96% (о/о); 3.2. етанол (3.1), разреден до 40% с вода; 3.3. разтвор на танин, 10% (т/о) – приготвя се от пречистен, пулверизиран танин; 3.4. 1,2-дихлоретан, ч.з.а.; 3.5. разтвор на безводен натриев карбонат, ч.з.а., 10%, (т/о); 3.6. солна киселина, 37% (т/о), плътност 1,19; 3.7. абсолютен алкохол, ч.з.а.; 3.8. реактив с 2,4-динитрофенилхидразин – 40 mg 2,4-динитрофенилхидразин, ч.з.а., се разтварят при кипене в около 40 ml абсолютен алкохол (3.7); оставя се да се охлади и се пренася в мерителна колба от 50 ml; добавя се 1 ml солна киселина (3.6.) и обемът се допълва с абсолютен алкохол (3.7.); приготвя се непосредствено преди употреба; 3.9. амоняк, 25% (т/о), плътност 0,91; 3.10. смес на амоняк с етанол – смесва се 1 обем етанол (3.7) с 1 обем амоняк (3.9). 3.11. стандартни разтвори на менадион – разтварят се 20 mg менадион (витамин K3) в 1,2-дихлоретан (3.4) и обемът се довежда до 200 ml. Аликвоти от този резервен разтвор се разреждат с 1,2-дихлоретан (3.4) така, че да се получи серия от разтвори, с концентрации между 2 и 10 mg/ml; тези разтвори трябва да бъдат свежо приготвени. 4. Апаратура: 4.1. механична клатачка; 4.2. центрофуга (3000 – 5000 min-1); 4.3. делителни фунии от 100 и 250 ml с шлифови запушалки; 4.4. ротационен вакуумизпарител с колби от 250 ml; 4.5. водна баня; 4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm. 5. Процедура Забележка: Всички операции трябва да бъдат проведени далеч от пряка светлина, с използване на оборудване от тъмно стъкло, където е необходимо. 5.1. Проба за изследване От фино раздробената проба се взема проба за изследване, в зависимост от предполагаемото съдържание на менадион, напр.: от 0,1 до 5 g, за концентрати и премикси; от 20 до 30 g, за продукти за изхранване на животни. Пробата се пренася незабавно в колба от 250 ml с шлифована запушалка. 5.2. Екстракция Към пробата се прибавят точно 96 ml разреден етанол (3.2) и механично се разклаща 15 min при стайна температура. След това се прибавят 4 ml разтвор на танин (3.3), смесва се, екстрактът се пренася в центрофужна епруветка, центрофугира се при 3000 до 5000 min-1 и се декантира. Точно премерени 20 до 40 ml от екстракта се пренасят в делителна фуния от 250 ml, добавят се с пипета 50 ml 1,2-дихлоретан (3.4), смесва се и се добавят с пипета 20 ml разтвор на натриев карбонат (3.5). Разклаща се енергично 30 sec, след което фазата на дихлоретана се събира в делителна фуния от 100 ml. Добавят се 20 ml вода, разклаща се отново за 15 sec и фазата на дихлоретана се събира, като се отделят следите от вода с лентички филтърна хартия. При концентрати и премикси се взема аликвота от екстракта и се разрежда с 1,2-дихлоретан (3.4) така, че да се получи концентрация на менадион от 2 до 10 mg/ml. При продукти за изхранване на животните аликвота от екстракта се изпарява до сухо под намалено налягане в азотна атмосфера на водна баня при 40°C. Остатъкът се обработва бързо с 1,2-дихлоретан (3.4) така, че да се получи концентрация на менадион от 2 до 10 mg/ml. 5.3. Образуване на хидразон 2 ml от дихлоретановия екстракт, получен в т. 5.2, се пренасят в мерителна колба от 10 ml и се добавят 3 ml от реактива с 2,4-динитрофенилхидразин. Колбата се затваря здраво със запушалка от корк или тефлон, за да се избегне изпаряването, и се нагрява два часа при 70°C на водна баня. Оставя се да се охлади, добавят се 3 ml смес на амоняк и етанол (3.10), смесва се, допълва се обемът с абсолютен етанол и отново се смесва. 5.4. Измерване на оптическата плътност Оптическата плътност на синьозелено оцветения комплекс се измерва на спектрофотометър при 635 nm срещу проба на реагента, получена чрез обработване на 2,0 ml 1,2-дихлоретан (3.4), както е посочено в т. 5.3. Количеството на менадиона се определя по калибровъчна крива, построена за всяка серия анализи. 5.5. Калибровъчна крива 2 ml от стандартните разтвори на менадион (3.11) се обработват, както е описано в т. 5.3. Оптическата плътност се измерва, както е посочено в т. 5.4. Калибровъчната крива се построява, като значенията на оптическата плътност се нанасят по ординатата, а съответните количества менадион в mg – по абсцисата. 6. Пресмятане на резултатите Количеството на менадион в пробата се пресмята, като се вземат предвид теглото на пробата и разрежданията, направени в хода на анализа. Резултатите се изразяват в mg менадион на kg. 7. Повторяемост Разликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишават: • 20%, като относителна стойност – за съдържание на менадион по-малко от 10 ppm; • 2 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 10 и 14 ppm; • 15%, като относителна стойност – за съдържание между 14 и 100 ppm; • 15 ppm, като абсолютна стойност – за съдържание между 100 и 150 ppm; • 10%, като относителна стойност – за съдържание по-голямо от 150 ppm. XXXVII. Определяне на Афлатоксин B1 А. МЕТОД НА ЕДНОДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ 1. Цел и обхват Този метод позволява определяне на количеството Афлатоксин B1 в следните храни за животни: фъстъци, копра, ленено семе, соя, сусам, кюспе от бабасу, палмово и царевично масло, готови тестени храни и зърнени продукти, грахово брашно, картофен пулп и нишесте. Долната граница на определение е 0,01 mg/kg (10 ppb). В присъствието на пречещи субстанции, които затрудняват определението, е необходимо да се започне анализът отново, като се използва метод Б (двудименсионална тънкослойна хроматография). 2. Принцип Пробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът се разтваря повторно в определен обем хлороформ или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се подлага на тънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин B1 се определя с ултравиолетово облъчване на хроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартен Афлатоксин B1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин B1 трябва да бъде потвърдена по посочената процедура. 3. Реактиви: Забележка: Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ А.Р., освен когато е посочено друго. 3.1. ацетон; 3.2. хлороформ, стабилизиран с 0,5 до 1,0% 96% етанол (v/v); 3.3. нормален хексан; 3.4. метанол; 3.5. безводен диетилов етер, свободен от прекиси; 3.6. смес на бензол и ацетонитрил: 98/2 (v/v); 3.7. смес на хлороформ (3.2) и метанол (3.4): 97/3 (v/v); 3.8. силикагел, за колонна хроматография с размер на частиците 0,05 до 0,20 mm; 3.9. абсорбент памучна вата, предварително обезмаслена с хлороформ, или стъклена вълна; 3.10. натриев сулфат, безводен, на гранули; 3.11. инертен газ, напр. азот; 3.12. 1N солна киселина; 3.13. 50% (v/v) сярна киселина; 3.14. кизелгур (hyflosupercel), промит в киселина; 3.15. силикагел G-HR или равностоен на него, за TCX; 3.16. стандартен разтвор с около 0,1 \mug Афлатоксин B_1 на милилитър в хлороформ (3.2) или смес бензин/ацетонитрил (3.6), приготвен и проверен, както е посочено в раздел 7; 3.17. стандартен разтвор за качествен анализ, съдържащ около 0,1 \mug Афлатоксин B_1 и B_2 на ml в хлороформ (3.2) или смес бензол/ацетонитрил (3.6). Тези концентрации са дадени като насока. Те трябва да се уточнят така, че да се получи еднакъв интензитет на флуоресценция и за двата афлатоксина; 3.18. разтворители за проявяване: 3.18.1. хлороформ (3.2) /ацетон (3.1): 9/1 (V/V), ненаситена вана; 3.18.2. диетилов етер (3.5) /метанол (3.4) /вода: 96/3/1 (V/V/V), ненаситена вана; 3.18.3. диетилов етер (3.5) /метанол (3.4) /вода: 94/4 5/15 (V/V/V), наситена вана; 3.18.4. хлороформ (3.2) /метанол (3.4): 94/6 (V/V), наситена вана; 3.18.5. хлороформ (3.2) /метанол (3.4): 97/3 (V/V), наситена вана. 4. Апаратура: 4.1. мелница-миксер; 4.2. апарат за бълникане (шейкър) или магнитна бъркалка; 4.3. нагъната филтърна хартия, Schlieicher and Schuell N 588, или равностойна, диаметър: 24 cm; 4.4. стъклена тръба за хроматография (вътрешен диаметър: 22 mm, дължина: 300 mm) с кран и 250 ml резервоар; 4.5. ротационен вакуум-изпарител, с 500 ml облодънна колба; 4.6. 500 ml конусни колби със стъклени запушалки с шлиф; 4.7. апарат за TCX; 4.8. стъклени блюда за TCL, 200 \times 200 mm, приготвени както следва (посочените количества са достатъчни за пет блюда). Поставят се 30 g силикагел G-HR (3.15) в конусна колба. Добавят се 60 ml вода, запушва се и се разклаща 1 min. Суспензията се разстила върху блюдата така, че да се получи равномерен слой с дебелина 0,25 mm. Оставя се да изсъхне на въздух и след това в ексикатор със силикагел. В момента на ползване блюдата се активират, като се държат в сушилня при 110 °C в продължение на 1 h. Готови за ползване блюда са подходящи, ако дават резултати, сходни с тези, които се получават при използването на блюдата, приготвени по описания начин. 4.9. ултравиолетова лампа с голяма дължина на вълната (360 nm); интензитетът на облъчване трябва да позволява петно 1 ng Афлатоксин B_1 да може ясно да се разграничава върху TCX блюдото на разстояние 10 cm от лампата; 4.10. 10 ml градуирани епруветки с полиетиленови запушалки; 4.11. ултравиолетов спектрофотометър; 4.12. флуороденситометър (по избор). 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата (виж. при „Наблюдения“, част B, т. 1) Пробата се смила така, че цялата да преминава през сито 1mm (съгласно препоръка ISO R 565). 5.2. Екстрахиране Поставят се 50 g смляна, хомогенизирана проба в 500 ml конусна колба (4.6). Добавят се 25 g кизелгур (3.14), 25 ml вода и 250 ml хлороформ (3.2). Колбата се запушва, разклаща се или се бърка 30 min с апарата (4.2) и се филтрува през нагъната филтърна хартия (4.3). Първите 10 ml от филтрата се изхвърлят и после се събират 50 ml. 5.3. Колонно очистване В долния край на хроматографската тръба (4.4) се вкарват запушалка от памучна вата или стъклена вълна (3.9), напълват се две трети от тръбата с хлороформ (3.2) и се добавят 5g натриев сулфат (3.10). Проверява се горната повърхност на пласта от натриев сулфат да е равна, след това се добавя 10 g силикагел (3.8) на малки порции. Разбърква се добре след всяко прибавяне, като се избягва образуване на мехурчета. Изчаква се да престои 15 min и след това внимателно се добавят 15 g натриев сулфат (3.10). Оставя се течността да спадне точно до над горната повърхност на слоя натриев сулфат. Смесват се 50 ml екстракт, събран в (5.2) със 100 ml нормален хексан (3.3), и количествено сместа се прехвърля в колоната. Изчаква се течността да спадне точно до над горната повърхност на слоя натриев сулфат. Изхвърлят се промивните води. След това се добавят 100 ml диетилов етер (3.5) и отново се изчаква да спадне до над горната повърхност на слоя натриев сулфат. При тези операции се следи дебитът да е 8 до 12 ml в min и колоната да не изсъхва. Изхвърля се течността, която изтича. След това се елюира със 150 ml смес хлороформ / метанол (3.7) и се събира целият елюат. Изпарява се последният почти до сухо при температура, не по-висока от 50 °C и в поток инертен газ (3.11) с ротационния изпарител (4.5). Количествено се прехвърля остатъкът, като се използва хлороформ (3.2) или смес бензол / ацетонитрил (3.6) в 10 ml градуирана епруветка (4.10). Концентрира се разтворът в поток от инертен газ (3.11) и след това се наглася обемът до 2 ml с хлороформ (3.2) или смес бензол / ацетонитрил (3.6). 5.4. Тънкослойна хроматография Върху ТСХ блюдото (4.8) на 2 cm от долния ръб и на разстояния от 2 cm се капват обемите стандартен разтвор и екстракт, посочени по-долу: – 10, 15, 20, 30 и 40 \mu\text{l} от стандартния разтвор на Афлатоксин B_1 (3.17); – 10 \mu\text{l} от екстракта, получен в 5.3, и на същото място отгоре 20 \mu\text{l} от стандартния разтвор (3.16); – 10 и 20 \mu\text{l} от екстракта, получен в 5.3. Хроматограмата се проявява на тъмно с един от проявителите разтвори (3.18). Изборът на разтворител трябва да е направен предварително чрез нанасяне на 25 \mu\text{l} от качествения стандартен разтвор (3.17) върху блюдото и след проявяване – проверка дали Афлатоксин B_1 и B_2 са напълно разделени един от друг. Разтворителите се оставят да се изпарят на тъмно и след това се облъчват с ултравиолетова светлина, като блюдото се поставя на 10 cm от лампата (4.9). Петната Афлатоксин B_1 дават синя флуоресценция. 5.5. Количествени определения Определя се или визуално, или чрез флуороденситометрия. 5.5.1. Визуални измервания Определя се количеството Афлатоксин B_1 в екстракта, като се сравнява интензитетът на флуоресценция на петната с екстракт с този на петната със стандартен разтвор, и се намира на кое съответства. Интерполира се, ако се налага. Флуоресценцията, получена чрез наслагване на екстракта върху стандартния разтвор, трябва да е по-интензивна от тази на 10 \mu\text{l} от екстракта и да има не повече от едно видимо петно. Ако интензитетът на флуоресценция на 20 \mu\text{l} от екстракта е по-голям от този на 40 \mu\text{l} от стандартния разтвор, екстрактът се разрежда 10 или 100 пъти с хлороформ (3.2) или смес бензол / ацетонитрил (3.6), преди да се подложи отново на тънкослойна хроматография. 5.5.2. Измерване чрез флуороденситометрия Измерва се интензитета на флуоресценция на петната Афлатоксин B_1 с флуороденситометъра (4.12) при дължина на вълната на възбуждане 365 nm и дължина на вълната на излъчване 443 nm. Определя се количеството Афлатоксин B_1 в петната екстракт чрез сравняване на интензитета на флуоресценцията им с този на петната стандартен Афлатоксин B_1. 5.6. Потвърждаване идентичността на Афлатоксин B_1 Потвърждава се идентичността на Афлатоксин B_1 в екстракта, както е посочено по-долу. 5.6.1. Обработка със сярна киселина Напръсква се (спрей) сярна киселина (3.13) върху хроматограмата, получена в 5.4. Флуоресценцията на петната Афлатоксин B_1 при ултравиолетово облъчване трябва да се превърне от синя в жълта. 5.6.2. Двудименсионална хроматография, свързана с образуване на Афлатоксин B_1-полуацетал (Афлатоксин B_2A) Забележка: описаните по-долу операции трябва да се извършват, като се спазва точно схемата на фигура 1. Фиг. 1 5.6.2.1. Нанасяне на разтворите Необходимо е да се маскират две прави линии върху блюдото (4.8), успоредни на две съседни страни (на 6 cm от всяка страна), за да се ограничи миграцията на фронтовете разтворител. Върху блюдото с капилярни пипети или микроспринцовки се капват следните разтвори: – върху точка A – обем от пречистен екстракт от пробата, получен в 5.3, съдържащ около 2,5 nm Афлатоксин B_1; – върху точки B и C: 25 \mu\text{l} от стандартния разтвор (3.16). 5.6.2.2. Проявяване Проявява се хроматограмата в направление I на тъмно, като се използва проявителят разтворител (3.18.1) (1 cm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя стигне до ограничителната за разтворителя линия. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура в продължение на 5 min. След това се напръсква със сярна киселина (3.12) по дължината на ивица 2,5 cm височина, покривайки точки A и B (показани със защрихованата площ на фиг. 1) докато потъмнее, като останалата част от блюдото се защити със стъкло. Оставя се да взаимодейства 10 min на тъмно и се изсушава във въздушен поток при стайна температура. След това се проявява хроматограмата в направление II на тъмно, като се използва проявителят разтвор (3.18.1) (1 cm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне ограничителната линия разтворител. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне при стайна температура. 5.6.2.3. Интерпретация на хроматограмите Хроматограмата се изследва под ултравиолетова светлина (4.9) и се проверява за следните характеристики: А) поява на синьо флуоресцентно петно от Афлатоксин B_1, с източник стандартния разтвор, нанесен в С (миграция в направление I); Б) поява на синьо флуоресцентно петно на нереагирал (със солната киселина) Афлатоксин B_1 и по-интензивно синьо флуоресцентно петно на Афлатоксин B_1-полуацетал, като и двете са с източник стандартния разтвор, нанесен в В (миграция в направление II); В) поява на петна, отговарящи на тези, описани в Б, с източник екстракта от пробата, нанесен в А. Положението на тези петна се определя първо чрез миграционното отстояние на Афлатоксин B_1 от точка А в направление I (същото, като изминатото от стандарта, нанесен в С) и след това чрез миграционните отстояния от там в направление II на Афлатоксин B_1-полуацетала (същите като тези, изминати от стандарта, нанесен в В). Интензитетите на флуоресценция на петната полуацетал с източник екстракта и от стандарта, нанесен във В, трябва да съвпадат. 6. Изчисляване на резултатите 6.1. От визуалните измервания Съдържанието Афлатоксин B_1 в \mu\text{g} на \text{kg} проба (PPB) се определя по формулата S.Y.V W.X където Y и X са съответно обемите в \mu\text{l} на стандартен разтвор на Афлатоксин B_1(3.16) и екстрат, имащ подобен интензитет на флуоресценция; S е концентрацията в \mu\text{g} Афлатоксин B_1 в стандартен разтвор; V – крайният обем на екстракта в \mu\text{l}, според необходимото разреждане; W – теглото на пробата в g според обема на екстракта, нанесен на колоната за пречистване 6.2. От флуороденситометричните измервания съдържанието Афлатоксин B_1 в \mu\text{g} на \text{kg} проба (PPB) се определя по формулата: S.V W.Y където: Y е обемът в \mu\text{l} от екстракта; S – количеството в ng Афлатоксин B_1 в екстракта (пропорционално на количеството Y), получено при измерването; V – краен обем в \mu\text{l}, според необходимото разреждане; W – теглото на пробата в g според обема на екстракта, нанесен на колоната за пречистване. 7. Приготвяне и анализ на стандартен разтвор (3.16) 7.1. Определяне на концентрацията Афлатоксин B_1 Приготвя се стандартен разтвор на Афлатоксин B_1 в хлороформ (3.2) или в смес бензол / ацетонитрил(3.6) с концентрация 8 до 10 \mu\text{g} / \mu\text{l}. Определя се абсорбционният спектър между 330 и 370 nm с помощта на спектрофотометър (4.11). Измерва се оптичната плътност (A) при 363 nm за хлороформен разтвор, или при 348 nm за разтвора бензол/ацетонитрил. Изчислява се концентрацията в \mu\text{g} Афлатоксин B_1 на 1 ml разтвор по следната формула: 312.A.1000 — за хлороформения разтвор; 20\,600 312.A.1000 — за разтвора от смес на бензол/ацетонитрил. Разрежда се според необходимостта, далеч от дневна светлина, за да се получи работен стандартен разтвор с концентрация Афлатоксин B_1 приблизително 0,1 \mu\text{g}/\mu\text{l}. Когато се държи в хладилник при 4 °C, този разтвор е стабилен две седмици. 7.2. Проверка на хроматографската честота Върху блюдо (4.8) се капва 5 \mu\text{l} от стандартния разтвор Афлатоксин B_1, съдържащ от 8 до 10 \mu\text{g}/\mu\text{l} (7.1). Хроматограмата се проявява, както е посочено в 5.4. В ултравиолетова светлина хроматограмата трябва да показва само едно петно и в първоначалната зона на нанасяне не трябва да се забелязва никаква флуоресценция. 8. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени с една и съща проба от един и същ аналитик, не трябва да бъде повече от: — 25% по отношение най-високия резултат за съдържания Афлатоксин B_1 от 10 и до 20 \mu\text{g} / \text{kg}; — 5 \mu\text{g}, в абсолютна стойност, за съдържания по-големи от 20 и до 50 \mu\text{g} / \text{kg}; — 10% по отношение най-високата стойност за съдържания над 50 \mu\text{g} / \text{kg}. 9. Възпроизводимост Виж под „Наблюдения“, част С, т. 2. Б.ДВУДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ 1. Цел и обхват Този метод позволява определяне количеството Афлатоксин B_1 в храни за животни, непопадащи в обхвата на метод А. Долната граница на определение е 0,01 mg / kg (10ppb). Методът е неприложим към храни, съдържащи пулп от цитрусови плодове. 2. Принцип Пробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът повторно се разтваря в определен обем хлороформ, или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се подлага на тънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин B1 се определя с ултравиолетово облъчване на хроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартен Афлатоксин B1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин B1 трябва да бъде потвърдена по посочената процедура. 3. Реактиви: Забележка. Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ А.Р., освен когато е посочено друго. 3.1. ацетон; 3.2. хлороформ, стабилизиран с 0,5 до 1,0% 96% етанол (v/v); 3.3. нормален хексан; 3.4. метанол; 3.5. безводен диетилов етер, свободен от прекиси; 3.6. смес на бензол и ацетонитрил: 98/2 (v/v); 3.7. смес на хлороформ (3.2) и метанол (3.4): 97/3 (v/v); 3.8. силикагел, за колонна хроматография с размер на частиците 0,05 до 0,20 mm; 3.9. абсорбент памучна вата, предварително обезмаслена с хлороформ, или стъклена вълна; 3.10. натриев сулфат, безводен, на гранули; 3.11. инертен газ, напр. азот; 3.12. 1N солна киселина; 3.13. кизелгур (Hyflosupercel), промит в киселина; 3.14. силикагел G-HR или равностоен на него, за ТСХ; 3.15. проявители разтворители: 3.15.1. диетилов етер (3.5) / метанол (3.4)/ вода: 94/4.5/1.5 (v/v/v), наситена вана; 3.15.2. хлороформ (3.2)/ ацетон (3.1): 9/1 (v/v), ненаситена вана; 3.16. стандартен разтвор с около 0,1 µg Афлатоксин B1 на ml в хлороформ (3.2) или смес бензин/ацетонитрил (3.6), приготвен и проверен, както е посочено в т. 7 на метод А. 4. Апаратура виж в точка 4 на метод А. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата – виж т. 5.1, 5.2 и 5.3 на метод А 5.2. Екстрахиране 5.3. Колонно очистване 5.4. Двудименсионална ТСХ 5.4.1. Нанасяне на разтворите (спазва се схемата на фиг.1) Маркират се две прави линии върху едно блюдо (4.8), успоредни на две съседни страни (на 5 и 6 cm от всяка страна съответно), за да се ограничи миграцията на фронтовете на разтворителя. Капват се следните разтвори върху блюдото, като се използват капилярни пипети или микроспринцовки: – върху точка A, 20 µl от пречистения екстракт от пробата, получен в 5.3; – върху точка B, 20 µl от стандартния разтвор (3.16); – върху точка B, 10 µl от стандартния разтвор (3.16); – върху точка C, 20 µl от стандартния разтвор (3.16); – върху точка D, 40 µl от стандартния разтвор (3.16). Изсушава се в бавен въздушен поток или инертен газ (3.11). Получените петна трябва да са с диаметър около 5 mm. Фиг. 2 5.4.2. Проявяване (спазва се схемата от фиг. 2) Хроматограмата се проявява в направление I на тъмно, като се използва проявителят разтворител (3.15.1) (1 cm слой в наситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне до ограничителната за разтворителя линия. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура за 15 min. След това хроматограмата се проявява в направление II на тъмно, като се използва проявителят разтворител (3.15.2) (1 cm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне ограничителната за разтворителя линия. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура. Фиг. 3 5.4.3. Интерпретация на хроматограмите (спазва се схемата на фиг. 3) Хроматограмата се облъчва с ултравиолетова светлина, като блюдото се поставя на 10 cm от (4.9). Локализира се положението на сините флуоресцентни петна B, C и D и E на Афлатоксин B1 от стандартния разтвор. Прокарват се две въображаеми линии през тези петна и под прав ъгъл към направленията на проявяване. Пресечницата P на тези линии е мястото, където се очаква да се открие петното Афлатоксин B1 с източник екстракта на пробата, нанесен в A (фиг. 2). Действителното местоположение на петното Афлатоксин B обаче може да бъде в точка Q в пресечницата на две въображаеми прави линии, образуващи ъгъл, приблизително 100 °C между тях, и преминаващи през петната B и C съответно. Определя се количеството Афлатоксин B1 в екстракта от пробата, както е посочено в 5.5. 5.4.4. Допълнителна хроматография Маркират се две прави линии върху едно ново блюдо (4.8), успоредни на две съседни страни, както е посочено на схемата на фиг. 2, и върху точка A се нанася 20 \mu\text{l} от пречистения екстрат от пробата, получен в 5.3, и върху тях – 20 \mu\text{l} от стандартния разтвор (3.16). Проявява се, както е посочено в 5.4.2. Хроматограмата се облъчва с ултравиолетова светлина (4.9) и се проверява дали: – петната Афлатоксин B1 от екстракта и от стандартния разтвор са насложени едно върху друго; – флуоресценцията на това петно е по-интензивна от тази на петното Афлатоксин B1, проявено в точка Q върху първото блюдо. 5.5. Качествено определение Определят се или визуално, или чрез флуоресцентометрия. 5.5.1. Визуални измервания Определя се количеството Афлатоксин B1 в екстракта, като се сравни интензитетът на флуоресценция на петната с екстракт с този на петната C, D и E от стандартния разтвор. Интерполира се, ако се налага. Ако интензитетът на флуоресценция на 20 \mu\text{l} от екстракта е по-голям от този на 40 \mu\text{l} от стандартния разтвор, екстрактът се разрежда 10 или 100 пъти с хлороформ (3.2) или смес бензол/ацетонитрил (3.6), преди да се подложи отново на тънкослойна хроматография. 5.5.2. Измерване чрез флуороденситометрия Измерва се интензитетът на флуоресценция на петната Афлатоксин B1 с флуороденситометъра (4.12) при дължина на вълната на възбуждане 365 nm и дължина на вълната на излъчване 443 nm. Определя се количеството Афлатоксин B1 в петното екстракт, като се сравнява неговият интензитет на флуоресценция с този на петна C, D и E от стандартния разтвор. 5.6. Потвърждаване идентичността на Афлатоксин B1 виж т. 5.6 от метод A 6. Изчисляване на резултатите виж т. 6 от метод A 7. Повторяемост виж т. 8 от метод A 8. Възпроизводимост виж „Наблюдения“, част B, т. 2 B. Наблюдения по отношение методи A и B 1. Обезмасляване Проби, съдържащи повече от 5% мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с петролев етер (т.к. 40 до 60 °C) след приготвянето им по 5.1. В такива случаи резултатите от анализа трябва да се изразят чрез теглото на необезмаслената проба. 2. Възпроизводимост на резултатите Възпроизводимостта на резултатите, т.е. разликите в резултатите, получени от две или повече лаборатории с една и съща проба, се изчислява, както следва: \pm 50\% от средната стойност – за средни стойности Афлатоксин B1 от 10 и до 20 \mu\text{g/kg}; \pm 10\mu\text{g/kg} върху средната стойност – за средни стойности, по-високи от 20 и до 50 \mu\text{g/kg}; \pm 20\% средната стойност – за средни стойности над 50 \mu\text{g/kg}. XXXVIII. Определяне на авопарцин чрез дифузия в среда на агар 1. Цел и обхват Методът се използва за определянето на авопарцин в храните за животните и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 2 mg/kg (2 части на хиляда). Присъствието на полиетерни антибиотици може да окаже влияние при определянето. 2. Принцип Пробата се извлича със смес от ацетон/вода/солна киселина. Антибиотичната активност на екстракта се определя посредством измерване на дифузията на авопарцина в среда от агар с бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в рамките на спектъра от използваните антибиотични концентрации. 3. Микроорганизъм – бацилус субтилис АТСС 6633 (NCIB 8054) 3.1. Поддържане на щамова култура Прави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис и се оставя да пренощува при температура 30 °C. Културата се съхранява в хладилник при температура около 4 °C. Ежемесечно се правят нови посевки. 3.2. Подготовка на суспензията от спори (1) Обира се добивът от неотдавна подготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml стерилна вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1), съдържаща се в колба на Рукс, и се оставя да престои 3 до 5 дни при температура 30 °C. Добивът се обира в 15 ml етанол (4.2), след като се провери под микроскоп формирането на малки спори, и се смесва добре. Тази суспензия може да се запази в продължение на най-малко 5 месеца при температура около 4 °C. 4. Културни среди и реагенти 4.1. Културна среда: Пептон 6,0 Триптофан 4,0 Екстракт от дрожди 3,0 Глюкоза 1,5 Агар 1,0 Вода 1000 ml pH 6,5 (след стерилизация). 4.2. Етанол 20 % (обем/обем) – 200 ml етанол се разреждат с 800 ml вода. 4.3. Солна киселина, отн. т. разреждане 1 – 18 до 1 – 19; (1) могат да се използват и други методи, при условие че се установи, че дават аналогични суспензии от спори; (2) може да се използва всяка продавана на пазара среда с аналогичен състав, която дава същите резултати. 4.4. Натриева основа, разтвор 2 М разтвор. 4.5. Фосфатен буфер, 0,1М – калиев дихидроген фосфат, KH2PO4 – 13,6 g. Вода до 1000 ml. Стойността на pH се регулира на 4,5. 4.6. Смес на ацетон/вода/солна киселина (4.3) – 65/32,5/2,5 (v/v/v). 4.7. Стандартна субстанция - авопарцинов сулфат с позната активност. 5. Стандартни решения Точно претеглено количество от приблизително 10 mg от стандартната субстанция (4.7) се разтваря във фосфатен буфер (4.5) и се разрежда с този буфер, така че да се получи основен разтвор, съдържащ 100 μg авопарцин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4°C, този разтвор остава стабилен в продължение на до 7 дни. 5.1. За предварителни смеси От този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните разтвори: S8 4 mg/l S4 2 mg/l S2 1 mg/l S1 0,5 mg/l 5.2. За храни за животни От този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните разтвори: S8 2 mg/l S4 1 mg/l S2 0,5 mg/l S1 0,25 mg/l 6. Подготвяне на екстракта и разтворите за анализ 6.1. Предварителни смеси Претегля се възможно най-близко до 10 mg достатъчно количество проба, която да съдържа 10 до 100 mg авопарцин. Прехвърля се в градуирана колба от 100 ml с 60 ml от сместа (4.6) и се разклаща в продължение на 15 min на механичен шейкър. Проверява се киселинността и pH се довежда до стойност 2, ако е необходимо, се използва солна киселина (4.3). Приготвя се обем със сместа (4.6) и се смесва добре. Една част се филтрира през подходяща филтърна хартия (напр. Уотман № 1), като се изхвърлят първите 5 ml от филтрата. Взима се една аликвотна част и pH се регулира до стойност 4,75 с разтвор на солна киселина (4.4). Този разтвор се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи очакваната концентрация на авопарцин от 4 μg/ml (= U8). От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 2 mg/l), U2 (очаквано съдържание: 1 mg/l) и U1 (очаквано съдържание: 0,5 mg/l) посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5). 6.2. Храни за животни Претеглят се 50 g от пробата и 100 ml от сместа (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на механичен шейкър. Екстрактът се избистря посредством центрофугиране (като се използват затапени центрофужни тръби), взима се аликвотна част от избистрения екстракт (виж таблицата) и се регулира киселинността на pH 4,5 с разтвор на натриев хидроксид (4.4). Тази аликвотна част се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи U8 (виж таблицата). От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 1 mg/l), U2 (очаквано съдържание: 0,5 mg/l) и U1 (очаквано съдържание: 0,25 mg/l), посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5). Ниво на авопарцина в (mg/kg) 5 7,5 10 15 20 40 Тегло на пробата (g(± 0,1g)) 50 50 50 50 50 50 Количество на разтвора (4.6)( ml) 100 100 100 100 100 100 Обем на чистия екстракт 20 15 20 15 20 10 Краен обем 25 25 50 50 100 100 Очаквана концентрация (mg/ml) 2 Прибл. 2 2 Прибл. 2 2 2 7. Процедура на анализиране на пробата 7.1. Посявка върху средата на пробата Приготвя се посявка на пробната среда (4.1) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до 60°C. Посредством предварителни опити върху панички с пробна среда (4.1) се определя количеството суспензия със спори, което е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране, при различните концентрации на авопарцин. 7.2. Подготвяне на паничките Дифузията през агара се осъществява в панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S_8, S_4, S_2, S_1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U_8, U_4, U_2, U_1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират достатъчно големи панички, които да позволят да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm при разстояние не по-малко от 30 mm между центровете в средата от агар. Опитът се извършва върху панички, състоящи се от лист стъкло с покрит алуминий или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В паничките се налива количество от средата (4.1), върху което е било направена посявка в съответствие с т. 7.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така, че да застане в равна позиция, пробиват се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата и стандартните разтвори (между 0,710 и 0,715 ml на отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се прилага поне четири пъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценяването на 32 зони на инхибиране. 7.3. Инкубация (престояване) Паничките се оставят да престоят в продължение на 16 до 18 h при температура 30°C. 8. Оценка Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху хартия за полулогаритмична графика (милиметрова), която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на „най-добро напасване“ както на стандартния разтвор, така и на екстракта. Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - 2S_8}{10} \quad (1) Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-високо ниво (SH) се определя по формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - 2S_1}{10} \quad (2) Аналогично се изчисляват точките на „най-добро напасване“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят U_1, U_2, U_4 и U_8 с S_1, S_2, S_4 и S_8 в посочените формули. Изчислените стойности на SL и SH се заместват върху млиметрова хартия и се свързват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UH и се свързват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за екстракта. В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите трябва да са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни при положение, че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности. Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U_1 и U_4 или U_8 и S_8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на „най-добро напасване“: SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на „най-добро напасване“ се проверяват за успоредност, така както е показано тук, погоре. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива. Ако се приеме, че линиите са успоредни, тогава се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм A) посредством една от следните формули: \text{За четири нива -} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) \text{За три нива -} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) \text{или} Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност. Ако бъде установено, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, то всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да се отбележи в крайния отчет. Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително. 9. Повторяемост Разликата между резултатите на двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и отедин и същ аналитик, не трябва да надвишава: – 2 mg/kg в абсолютна стойност за съдържания на авопарцин от 2 и нагоре до 10 mg/kg; – 20 % спрямо най-високата стойност – за съдържания от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържания от 25 до 50 mg/kg; – 10 % спрямо най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg. XXXIX. Определяне на монензин натрии посредством дифузия в среда на агар 1. Цел и обхват Методът се използва за определянето на монензин натрии в храните за животните и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 10 mg/kg (10 части на хиляда). 2. Принцип Пробата се извлича посредством 90 % метанол. Екстрактът се подлага на съответни процедури, в съответствие със съдържанието на монензин натрии в пробата. Антибиотичната активност се определя, като се измери дифузията на монензин натрии в среда от агар, върху която има посявка на бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в целия спектър на използваните антибиотични концентрации. Чувствителността на тази система на пробата за анализи се намалява в присъствието на натриеви йони. 3. Микроорганизъм – бацилус субтилис АТСС 6633 (NCIB 8054) 3.1. Поддържане на щамова култура Прави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис и се оставя да пренощува при температура 30°C. Културата се съхранява в хладник при температура около 4 °C. Нови посевки се правят ежемесечно. 3.2. Подготовка на суспензията от спори (2) Събира се добивът от наскоро приготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml стерилна вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1), съдържаща се в колба на Рукс, и се оставя да престои 3 до 5 дни при температура 30°C. Добивът се събира в 15 ml 20 % етанол (4.3), след като се проверява под микроскоп формирането на малки спори, и се смесва добре. Тази суспензия може да се запази в продължение на най-малко 5 месеца при температура около 4°C. 4. Културни среди и реагенти 4.1. Културна среда Триптофан 10 g Екстракт от дрожди 3 g Месо-костен екстракт 1,5 g Глюкоза 1 g Агар (по качество) 10 – 20 g Вода 1000 ml pH 6,5 (след стерилизация). 4.2. Среда на пробата за анализи Глюкоза 10 g Екстракт от мая 2,5 g Дикалиев хидроген фосфат K2HPO4 0,69 g Калиев дихидроген фосфат KH2PO4 0,45 g Агар (според качеството) 10 до 20 g Вода 1000 ml pH 6 (след стерилизация). Един mg натриев монензин е еквивалентен на 1,000 единици UK. Могат да се използват и други методи, при условие че се установи получаването на аналогични суспензии от спори. Може да се използва всяка продавана на пазара среда с аналогичен състав, която дава същите резултати. 4.3. Етанол 20 % (обем/обем) – разреждат се 200 ml етанол с 800 ml вода. 4.4. Метанол дехидратен. 4.5. Метанол 90 % (обем/обем) – разреждат се 900 ml метанол (4.4) със 100 ml вода. 4.6. Метанол 50 % (обем/обем) – разреждат се 500 ml метанол (4.4) с 500 ml вода. 4.7. Алуминиев окис, гранулиран (алкоа F, мрежа с 20 дупки; активиран алуминий UG1: фирма „Ланкастър и Ко.“ или еквивалент). 4.8. Стандартни субстанции: натриев монензин с позната активност (напр. от Международната лаборатория за биологични стандарти. Централна ветеринарна лаборатория, Уейбридж, Обединено кралство – Сърей КТ 15 3NB). 5. Апаратура 5.1. ротационен вакуумен изпарител с 250 ml колба с кръгло дъно; 5.2. стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 25 mm с дължина 400 mm, с един отворен край с диаметър 2 mm; 5.3. стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 11 mm с дължина приблизително 300 mm, с един отворен край с диаметър 2 mm. 6. Стандартни решения Разтваря се точно претеглено количество от стандартната субстанция (4.8) в метанол (4.4), така че да се получи основен разтвор, съдържащ 800 µg натриев монензин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4 °C, този разтвор остава стабилен в продължение на до две седмици. От този фондов разтвор се подготвят посредством последователно разреждане с 50 % метанол (4.6) следните разтвори: S_8 8 mg/l S_4 4 mg/l S_2 2 mg/l S_1 1 mg/l 7. Подготвяне на екстракта 7.1. Екстрахиране 7.1.1. Предварителни смеси Претегля се количество от пробата с тегло 2 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5), хомогенизира се и се центрофугира в продължение на няколко min. Изплувалият отгоре разтвор се разрежда с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 µg/ml (= U_8). 7.1.2. Храни за животни с ниво на натриевия монензин не по-малко от 50 частици на хиляда Претегля се количество от пробата с тегло от 10 до 20 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5), хомогенизира се в продължение на няколко min и разтворът се оставя да се утаи. Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.2) и се добавя алуминиев окис (4.7), като леко се почуква, докато колоната достигне височина 75 до 80 mm. Екстрактът се прелива върху колона от алуминиевия окис и филтратът се събира. Разреждат се 30 ml от филтрата до 50 ml с вода. След това се разрежда с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 µg/ml (= U_8). 7.1.3. Храни за животни с ниво на натриевия монензин, по-малко от 50 частици на хиляда (до една граница от 10 части на хиляда) Претегля се проба с тегло от 10 до 20 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5) и се хомогенизира в продължение на 15 min. Центрофугира се, докато разтворът стане прозрачен. За една проба, съдържаща 20 частици на хиляда (ppm) монензин натрии, се взимат 40 ml от изплувалата на повърхността течност. За проба, съдържаща 10 ppm, се взимат 80 ml и се изпаряват до изсъхване под вакуум върху ротационен изпарител (5.1) при температура не повече от 40 °C. Остатъкът се разтваря в 10 ml 90 % метанол (4.5). Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.3) и се добавя алуминиев окис (4.7), като леко се почуква, докато стълбът достигне височина 75 до 80 mm. Прелива се метаноловият разтвор на остатъка върху стълба от алуминиевия окис и се събира филтратът. Стълбът се измива с 10 ml 90 % метанол (4.5) и измитите разтвори се комбинират с филтрата. Разтворът се изпарява до изсъхване под вакуум върху ротационен изпарител (5.1) при температура не повече от 40 °C. Разтваря се остатъкът в 10 ml дехидриран метанол (4.4) и се добавя вода, докато се получи 20 ml. Разтворът се центрофугира при честота на въртене не по-малко от 4000 оборота/min в продължение на поне 5 min. След това се прави разреждане с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин 8 µg/ml (= U_8). 7.2. Разтвори на пробите за анализи От разтвор U_8 се подготвят разтвори U_4 (очаквано съдържание: 4 µg/ml), U_2 (очаквано съдържание: 2 µg/ml) и U_1 (очаквано съдържание: 1 µg/ml) посредством последователно разреждане (1 + 1) с 50 % разтвор на метанол (4.6). 8. Процедура за анализиране на пробата 8.1. Посявка върху средата на пробата Прави се посявка върху пробната среда (4.2) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до 60 °C. Посредством предварителни опити върху панички с пробна среда (4.2) се определя количеството суспензия със спори, което ще е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране при различните концентрации на натриев монензин. 8.2. Подготвяне на паничките Осъществява се дифузия през агара върху панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S_8, S_4, S_2, S_1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U_8, U_4, U_2, U_1). Четирите концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират достатъчно големи панички, които позволяват да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm с разстояние не по-малко от 30 mm между центровете в средата от агар. Опитът се провежда върху панички, състоящи се от лист стъкло с покрит алуминий или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В паничките се налива количество от средата (4.2), върху което е било направена посявка в съответствие с т. 8.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така, че да застане в равна позиция, правят се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата за анализи и стандартните разтвори (между 0,710 и 0,715 ml за всеки отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се прилага поне четири пъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценката на 32 зони на инхибиране. 8.3. Инкубация (престой) Паничките се оставят да престоят в продължение на приблизително 18 h при температура 35 до 37 °C. 9. Оценка Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на „най-добро напасване“ както на стандартния разтвор, така и на екстракта, както е показано например тук по-долу. Пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - 2S_8}{10} \quad (1) Определя се пунктът на „най-добро напасване“ за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - 2S_1}{10} \quad (2) Аналогично се изчисляват точките на „най-добро напасване“ за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместват U_1, U_2, U_4 и U_8 с S_1, S_2, S_4 и S_8 в посочените формули. Изчислените стойности на SL и SH се записват върху същата хартия за чертане на диаграми (милиметрова) и се обединяват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UH и се обединяват така, че да се получи линията на „най-добро напасване“ за екстракта. В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни, при положение че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности. Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U_1 и S_1, или U_8 и S_8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на „най-добро напасване“: SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на „най-добро напасване“ се проверят за успоредност, както е показано по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива. Ако се приеме, че линиите са успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм A) посредством една от следните формули: За четири нива – Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) За три нива – Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) или Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност. Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата от 0,75 до 2,70, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта, а ако това не е възможно – към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет. Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително. 10. Повторяемост Разликата между резултатите от двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и от един и същ аналитик, не трябва да надвишава: – 20 % спрямо най-високата стойност – за съдържания на монензин натрии от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържания от 25 до 50 mg/kg; – 10 % спрямо най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg. XL. Определяне на халофугинон DL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-квиназолин-4-(3H)-на хидробромид 1. Цел и обхват Методът се използва за определянето на халофугинон в храните за животните. Долната граница за определянето е 1 mg/kg. 2. Принцип След третиране с гореща вода халофугинонът се екстрахира като свободна основа в етилов ацетат и след това се разделя като хидрохлорид във воден киселинен разтвор. Екстрактът се очиства посредством хроматография с йонен обмен. Съдържанието на халофугинона се определя посредством високочестотна хроматография със запазена фаза (HPLC), като се използва детектор на ултравиолетови лъчи. 3. Реагенти: 3.1. ацетонитрил, клас HPLC; 3.2. амберлит XAD-2 смола; 3.3. амониев ацетат; 3.4. етилов ацетат; 3.5. оцетна киселина, глациална (във формата на лед); 3.6. халофугинон – стандартна субстанция DL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-квиназолин-4-(3H)-на хидробромид, E 764); 3.6.1. фондов стандартен разтвор на халофугинон, 100 mg/ml – претеглят се с точност до 0,1 mg 50 mg халофугинон (3.6) в градуирана колба с вместимост 500 ml, разтварят се в буферен разтвор на амониев ацетат (3.18), допълва се до маркировката с буферен разтвор и се смесва. Този разтвор остава стабилен в продължение на 3 седмици при температура 5°C, при положение че се съхранява на тъмно; 3.6.2. разтвори за калиброване – в една редица от градуирани колби с вместимост 100 ml се прехвърлят 1, 2, 3, 4 и 6,0 ml от основния стандартен разтвор на халофугинон (3.6.1). Допълва се до маркировката с подвижна фаза (3.21) и се смесва. Разтворите ще имат съответно концентрации на халофугинон 1, 2, 3, 4 и 6,0 ml. Преди употреба тези разтвори трябва да са прясно приготвени; 3.7. хидрохлорна (солна) киселина (r = 20 – в концентрация приблизително 1,16 g/ml); 3.8. метанол; 3.9. сребърен нитрат; 3.10. натриев аскорбат; 3.11. натриев карбонат; 3.12. натриев хлорид; 3.13. EDTA (етилен-диамин-тетра-оцетна киселина, двунатриева сол); 3.14. вода, клас HPLC; 3.15. разтвор на натриев карбонат, обем, равен на 10 g/100 ml; 3.16. натриев хлорид – наситен разтвор на натриев карбонат, обем, равен на 5 g/100 ml; 50 g натриев карбонат се разтварят (3.11) във вода, разрежда се до 1 l и се добавя натриев хлорид (3.12), докато се получи наситен разтвор; 3.17. солна киселина, приблизително 0,1 mol/l; 10 ml солна киселина се разтварят (3.7) във вода, докато се получи 1 l; 3.18. буферен разтвор на амониев ацетат, приблизително 0,25 – разтварят се 19,3 g амониев ацетат (3.3) и 30 ml оцетна киселина (3.5) във вода (3.14) и се разреждат до 1 l; 3.19. подготвяне на амберлит XAD-2 смола – измива се подходящо количество амберлит (3.2) с вода, докато бъдат отстранени всички хлоридни йони, като това се индицира посредством теста със сребърен нитрат (3.20), който се изпълнява в изхвърлената течна фаза. След това смолата се измива с 50 ml метанол (3.8), изхвърля се метанолът и се съхранява смолата под свеж метанол; 3.20. разтвор на сребърен нитрат, приблизително 0,1 mol/l – 0,17 g сребърен нитрат се разтварят (3.9) в 10 ml вода; 3.21. подвижна фаза HPLC – смесват се 500 ml ацетонитрил (3.1) с 300 ml буферен разтвор на амониев ацетат (3.3) и 1,200 ml вода (3.14). Киселинността се регулира на pH = 4,3, като се използва оцетна киселина (3.5). Филтрира се през филтър 0,22 mm (4.8) и разтворът се дегазира (напр. посредством почистване с ултразвук в продължение на 10 min). Този разтвор остава стабилен в продължение на един месец, при положение че се съхранява на тъмно място в затворен съд. 4. Апаратура: 4.1. ултразвукова баня; 4.2. ротационен филмов (тънкослоен) изпарител; 4.3. центрофуга; 4.4. оборудване HPLC, което има детектор на ултравиолетови лъчи с променлива дължина на вълната или детектор с диодна решетка; 4.4.1. течна хроматографска колона, 300 mm > 4 mm, C 18,10 mm опаковка, или еквивалентна колона; 4.5. стъклена колона (300 mm > 10 mm), снабдена с филтър от синтеровано стъкло и спирачно кранче; 4.6. филтри от стъкловлакно, с диаметър 150 mm; 4.7. мембранни филтри – 0,45 mm; 4.8. мембранни филтри – 0,22 mm. 5. Процедура Забележка. Халофугинонът като свободна основа е нестабилен в разтвори на алкалин и на етилов ацетат, ако не остане в етиловия ацетат в продължение на повече от 30 min. 5.1. Общи положения 5.1.1. Анализира се храна без добавки (чиста храна), за да се провери и удостовери това, че не присъстват нито халофугинон, нито други включени субстанции. 5.1.2. Провежда се тест за възстановяване, като се анализира храната без хранителни добавки, която е била подсилена посредством добавянето на известно количество халофугинон, аналогично на това, което присъства в пробата. За да се подсили на ниво 3 mg/kg, се добавят 300 ml от фондовия стандартен разтвор (3.6.1), докато се получи 11 от чистата храна, смесва се и се изчаква 10 min, преди да се продължи с екстрахирането (5.2). Забележка. За целите на този метод чистата храна трябва да е аналогична по вид на тази от пробата и при анализа да не се открие халофугинон. 5.2. Екстрахиране Претеглят се с точност до 0,1 mg 10 mg от подготвената проба в центрофужна тръбичка с вместимост 200 ml, добавят се 0,5 g натриев аскорбат (3.10), 0,5 g EDTA (етилен-диамин-тетра-оцетна киселина, двунатриева сол) (3.13) и 20 ml вода и се смесва. Тръбичката се поставя за 5 min във водна баня (80 °C). След охлаждане до стайна температура се добавят 20 ml разтвор на натриев карбонат (3.15) и се смесва. Незабавно се добавят 100 ml етилов ацетат (3.4) и се разклаща силно с ръка в продължение на 15 s. След това тръбичката се поставя за 3 min в ултразвукова баня (4.1) и се разхлабва запушалката. Центрофугира се в продължение на 2 min и се прелива фазата на етиловия ацетат през филтър от стъкловлакно (4.6) в разделителна фуния с вместимост 500 ml. Екстрахирането на пробата се повтаря с втора част от 100 ml етилов ацетат. Комбинираните екстракти се измиват в продължение на 1 min с 50 ml разтвор на натриев хлорид – наситен натриев карбонат (3.16) и се изхвърля водният слой. Екстрахира се органичният слой в продължение на 1 min с 50 ml солна киселина (3.17). Оставя се долният слой на киселината да изтече в разделителна фуния с вместимост 250 ml. Повторно се екстрахира органичният слой в продължение на една минута и половина с нови 50 ml разтвор на натриев хлорид и се комбинира с първия екстракт. Измиват се комбинираните киселинни екстракти посредством завъртане в продължение на приблизително 10 s с 10 ml етилов ацетат (3.4). Водният слой се прехвърля количествено в 250 ml колба с кръгло дъно и се изхвърля органичната фаза. Изпарява се целият останал етилов ацетат от киселинния разтвор, като се използва ротационен филмов (тънкослоен) изпарител (2.4). Температурата на водната баня не трябва да превишава 40°C. Под вакуум от приблизително 25 mbar целият остатъчен етилов ацетат ще бъде отстранен в рамките на 5 min при температура 38°C. 5.3. Почистване 5.3.1. Подготвяне на колоната с амберлит За всеки екстракт на пробата се подготвя по една колона XAD-2. 10 g от подготвения амберлит се прехвърлят (3.19) в стъклена колона (4.5) с метанол (3.8). Добавя се една малка запушалка от стъклен памук в горната част на коритото от смола. Оставя се метанолът да изтече от колоната и смолата се измива със 100 ml вода, като потокът се спира веднага, щом течността достигне горната част на коритото от смола. Оставя се колоната да се уравновеси за 10 min преди употреба. Не се допуска колоната да изтече напълно до сухо. 5.3.2. Почистване на пробата Екстрактът се прехвърля (5.2) количествено към горната част на подготвената колона от амберлит (5.3.1) и се отмива, като се изхвърля елюатът (отмитият разтвор). Скоростта на отмиване не трябва да превишава 20 ml/min. Колбата с кръгло дъно се изплаква с 20 ml солна киселина (3.17), която се използва и за да се измие колоната от смола. Евентуално останалият киселинен разтвор се продухва с въздушен поток. Изхвърлят се отмитите разтвори. Добавят се 100 ml метанол (3.8) към колоната и се оставя 5 до 10 min да изтече, като отмитият разтвор се събира в 250 ml колба с кръгло дъно. Оставя се останалият метанол за 10 min, за да влезе в равновесие със смолата, и се продължава отмиването със скорост 20 ml/min, като отмитият разтвор се събира в същата 250 ml колба с кръгло дъно. Изпарява се метанолът върху ротационния тънкослоен изпарител (4.2), като температурата на водната баня не трябва да превишава 40°C. Остатъкът се прехвърля количествено в 10 ml калибрована колба, като се използва подвижната фаза (3.21). Долива се до маркировката с мобилната фаза и се смесва. Една аликвотна (кратна) част се филтрува през мембранен филтър (4.7). Този разтвор се запазва за определяне посредством високочестотна хроматография със запазена фаза HPLC (5.4). 5.4. Определяне посредством HPLC 5.4.1. Параметри Следните условия се предлагат като ръководство, могат да се използват и други условия, при условие че с тях се получават еквивалентни резултати: течна хроматографска колона (4.4.1); мобилна фаза на HPLC (3.21); скорост на потока: 1,5 до 2 ml/min; дължина на вълната за откриване: 243 nm; обем за инжектиране: 40 до 100 ml; проверява се стабилността на хроматографската система, като се инжектира калибриращият разтвор (3.6.2), съдържащ 3 mg/ml, няколко пъти, докато се постигне постоянна височина на пиковете (или участъците) и време на задържане. 5.4.2. Графика на калибриране Всеки калибриращ разтвор се инжектира (3.6.2) няколко пъти и се измерват височините на пиковете (или участъците) за всяка концентрация. Начертава се графиката на калибриране, като се използват средните височини на пиковете (участъците) на калибриращите разтвори като ординати, а съответните концентрации в mg/ml – като абсциси. 5.4.3. Разтвор на пробата От пробата се инжектира (5.3.2) няколко пъти, като се използва същият обем, който е взет за калибриращите разтвори, и се определя средната височина на пиковете (участъкът) за халофугинона. 6. Изчисляване на резултатите Концентрацията на разтвора на пробата в mg/ml се определя от средната височина (участък) на пиковете за халофугинона, като се използват препратки към графиката на калибрирането (5.4.2). Съдържанието на халофугинона в тегловни проценти w (mg/kg) в пробата се дава със следната формула: c.10m w = \frac{}{m}, където: с е концентрацията на халофугинона в разтвора на пробата в mg/ml; m - масата на изпробваната част в грамове. 7. Валидизиране на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на анализираната субстанция може да се потвърди посредством успоредна хроматография или като се използва детектор с диодна решетка, с който се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибриращия разтвор (3.6.2), съдържащ 6,0 mg/ml. 7.1.1. Успоредна хроматография Екстракт на пробата се подсилва посредством добавянето на едно целесъобразно количество калибриращ разтвор (3.6.2). Количеството на добавения халофугинон трябва да е аналогично на приблизителното количество на халофугинона, намерен в екстракта на пробата. Само височината на пика на халофугинона следва да се увеличи, след като се вземе под внимание както добавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика, на половината от нейната максимална височина, трябва да бъде в рамките на \pm 10 \% от първоначалната широчина. 7.1.2. Откриване с диодна решетка Резултатите се оценяват съобразно следните критерии: (а) дължината на вълната за максималната абсорбция на пробата и на стандартните спектри, записана при пиковия връх върху хроматограмата, трябва да е една и съща в рамките на едно поле, определено от разрешителната (разделителната) способност на системата за откриване, за откриване с диодна решетка, тази дължина на вълната е обикновено в рамките на \pm 2 \text{ nm}; (б) между 225 и 300 nm пробата и стандартните спектри, записани при пиковия връх на хроматограмата, не трябва да са различни за тези части на спектъра в рамките на обхвата от 10 до 100 % от относителната абсорбция, този критерий се счита за спазен, когато присъстват едни и същи максимуми и в никой от наблюдаваните пунктове отклонението между двата спектъра превишава 15 % от абсорбцията на стандартната анализирана субстанция; (в) между 225 и 300 nm спектрите на горния склон върхът и долният склон на пика, които се произвеждат от екстракта на пробата, не трябва да се различават помежду си за тези части от спектъра в рамките на обхвата от 10 до 100 % от относителната абсорбция; този критерий се счита за спазен, когато присъстват едни и същи максимуми и когато при всички наблюдавани пунктове отклонението между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра на върха. Ако някой от тези критерии не бъде спазен, присъствието на анализираната субстанция не може да се счита за потвърдено. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, които се провеждат върху една и съща проба (мостра), не трябва да превишават 0,5 mg/kg за съдържание на халофугинон до 3 mg/kg. 7.3. Възстановяване За подсилената чиста проба възстановяването е минимум 80 %. 8. Резултати от съвместно изпитване Резултатите от съвместно изпитване, при което три проби са подложени на анализ от осем лаборатории, са представени в таблицата. Резултати Празна А при получаване Проба В (брашно) при получаване Проба В (брашно) след два месеца Проба С (гранули) при получаване Проба С (гранули) след два месеца Средна (1) n.d. 2.80 2.42 2.89 2.45 SR - 0,45 0,43 0,40 0,42 CVR - 16 18 14 17 Възстановяване - 86 74 88 75 (1) – единици в mg/kg n.d. - не е открито SR - стандартно отклонение на повторяемост CVR - коефицент на вариация на повторяемостта Възстановяване (%) XLI. Метод за определяне на робенидин 1. Определяне на robenidine 1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine-hydrochloride 1. Цели и обсег Този метод се използва за определяне съдържанието на robenidine във фуражите, като долната граница на определяне е 5 mg/kg. 2. Принцип Пробата се екстрахира с помощта на кисел метанол. Екстрактът се изсушава, след което аликвотна част от него се подлага на изчистване в колона с алуминиев окис. Robenidine се елуира от колоната с метанол. След като се концентрира, към него се добавя ново количество, за да се постигне подходящият за мобилната фаза обем. Съдържанието на robenidine се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с много високи работни характеристики на базата на утравиолетов детектор. 3. Реактиви 3.1. метанол; 3.2. кисел метанол – слагат се 4 ml солна киселина (P20с 1,18g/ml) в 500 ml градуирана колба. Напълва се с метанол до определената черта (3.1) и се разбърква. Разтворът се приготвя непосредствено преди употреба; 3.3. ацетонитрил, HPLC степен; 3.4. молекулярно сито – тип 3А с 8 до 12 мрежести отвора (1,6-2,5 mm отвори, кристален алумино силикат, диаметър на порите 0,3 mm); 3.5. алуминиев окис – I степен на киселинна реакция за колонна хроматография – 100 g алуминиев окис се прехвърлят в подходящ съд и се прибавят 2,0 ml вода. Запушва се и се разклаща за приблизително 20 min. Така полученият разтвор се съхранява в добре запушен съд; 3.6. разтвор на калиев дихидрогенен фосфат, c=0.025 mol/l – 3,40 g калиев дихидрогенен фосфат се разтварят във вода (HPLC степен) в 1000 ml градуирана колба. Допълва се до определената черта и се разбърква; 3.7. разтвор на двунатриев хидрогенен фосфат, c=0.025 \text{ mol/l} – 3,55 g безводен двунатриев хидрогенен фосфат (или 4,45 g дихидрат или 8,95 g от додекахидрат) се разтварят във вода (HPLC степен) в 1000-милиметрова колба. Допълва се до определената черта и се разбърква; 3.8. HPLC подвижна/мобилна фаза – смесват се следните реактиви: 650 ml ацетонитрил (3.3), 250 ml вода (HPLC степен), 50 ml разтвор на калиев дихидрогенен фосфат (3.6), 50 ml разтвор на двунатриев хидрогенен фосфат (3.7). През 0,22 \mu\text{m} филтър се прецежда (4.6) и се дегазира разтворът (напр. чрез утрасонификация за 10 min); 3.9. стандартна субстанция – чист robenidine – 1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino] guanidine hydrochloride, E 750; 3.9.1. изходен стандартен разтвор на robenidine – 300 \mu\text{g/ml} – отмерват се 30 g от стандартния робенидинов разтвор (3.9) до най-близките 0,1 mg на колбата. Разтваря се в кисел метанол (3.2) в 100 ml градуирана колба. Допълва се до определената черта със същия разтворител и се разбърква. Колбата се увива в алуминиево фолио и се поставя на тъмно място; 3.9.2. междинен стандартен разтвор на robenidine – 12 \mu\text{g/ml} – 10,0 ml от изходния стандартен разтвор се слагат (3.9.1) в 250 ml градуирана колба. Допълва се до количеството, необходимо за подвижната фаза, и се разбърква. Колбата се увива с алуминиево фолио и се съхранява на тъмно място; 3.9.3. калибрацинни разтвори – 5, 10, 15 и 20 ml от междиния стандартен разтвор се прехвърлят (3.9.2) в няколко 50 ml калибрирани колби. Допълват се до количеството, необходимо за подвижната фаза (3.8) и се разбъркват. Разтворите отговарят съответно на 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 и 6,0 \mu\text{g/ml} робенидин. Разтворите се приготвят непосредствено преди употреба. 4. Апаратура 4.1. стъклена колона – направена е от тъмно кехлибарено стъкло, снабдено със запорен кран. Резервоарът е приблизително с обем 150 ml, вътрешен диаметър от 10 до 15 mm и дължина 250 mm; 4.2. лабораторен механичен шейкър; 4.3. вакуумен ротационен изпарител на филма; 4.4. HPLC апарат с управилетов детектор с променлива дължина на вълните или диодно-клетъчен детектор, който работи в обхват 250 – 400 mm; 4.4.1. течна хроматографска колона – 300 mm \times 4 mm, C_{18}, 10 \mu\text{m} опаковка или еквивалент; 4.5. филтрова хартия със стъклени нишки (Whatman GF/A или еквивалент); 4.6. мембранни филтри, 0,22 \mu\text{m}; 4.7. мембранни филтри, 0,45 \mu\text{m}. 5. Процедура Забележка. Робенидинът е чувствителен към светлина. Да се използват тъмнокехлибарени стъкленици във всички операции. 5.1. Общи положения 5.1.1. Анализира се празна проба с цел да се провери наличието на робенидин или интерфериращи вещества. 5.1.2. Провежда се възстановителен тест, като се анализира празната проба (5.1.1), която е била усилена от допълнително количество робенидин, сходно с това в пробата. Пробата може да бъде усилена до ниво 60 mg/kg, като се прехвърлят 3,0 ml от изходния стандартен разтвор в отделна 250 ml конична колба. Разтворът се изпарява до 0,5 ml под азотна струя. Прибавят се 15 g от празната проба, смесва се добре и се изчаква 10 min, преди да се продължи с етапа на екстракция. Забележка. За целите на метода празната фуражна проба трябва да бъде сходна по вид с образеца и при анализ не трябва да се открие наличието на робенидин в нея. 5.2. Екстракция Отмерват се приблизително 15 g от приготвения образец до най-близките 0,01 g. Прехвърлят се в 250 ml колба и се добавят 100 ml кисел метанол (3.2), съдът се запушва добре и се бърка в шейкър в продължение на 1 h (4.2). Разтворът се прецежда през филтрова хартия със стъклени нишки (4.5) и целият филтрат се събира в 150 ml конична колба. Прибавят се 7,5 g от молекулярно сито (3.4), съдът се запушва добре и се разбива в продължение на 5 min. Незабавно се прецежда през филтрова хартия със стъклени нишки. Разтворът се запазва за етапа на пурификация (5.3). 5.3. Пурификация 5.3.1. Подготовка на колоната с алуминиев окис Долният край на стъклената колона се запушва (4.1) с тапа от стъклен памук и се уплътнява, като тапата се набутва навътре с помощта на стъклена пръчка. Отмерват се 11 g от приготвения алуминиев окис (3.5) и се прехвърлят в колоната. По време на опита влиянието на околната среда трябва да се сведе до минимум. Колоната се почуква леко в долния ѝ край, за да се избистри окисът. 5.3.2. Пурификация на пробата/образеца Прехвърлят се 5 ml от пробния екстрат, приготвен в (5.2), в колоната с помощта на пипета. Краят на пипетата се поставя близо до колонната стена и се оставя разтворът да се абсорбира от алуминиевия окис. Робенидинът от колоната се елюира, като се използват 100 ml метанол (3.1) при скорост на изтичане 2 до 3 ml/min. Елюираната субстанция се поставя в 250 ml колба с кръгло дъно. Метаноловият разтвор се подлага на изпаряване до изсъхване при намалено налягане от 40 °C във вакуумен ротационен филмов изпарител (4.3). Утайката се разтваря отново в 3 до 4 ml субстанция от подвижната фаза (3.8) и се прехвърля в 10 ml колба. Колбата се изплаква на няколко пъти с 1 до 2 ml от подвижната фаза и изплакнатите количества се прехвърлят в градуираната колба. Допълва се до определената черта със същия разтворител и се разбърква. Една аликвотна част от полученото вещество се филтрира през мембранни филтри 0,45 \mu\text{t} (4.7). Разтворът се запазва за определяне на HPLC. 5.4. Определяне на HPLC 5.4.1. Параметри Предлагат се следните условия за провеждане на анализа. Други условия могат да бъдат използвани, ако те дават равностойни резултати: – течна хроматографична колона (4.4.1), – HPLC подвижна фаза (3.8), – скорост на изтичане – 1,5 до 2 ml/min, – вълнова дължина на детектора – 317 nm, – обем за инжектиране – 20 до 50 \mu\text{l}. Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се инжектира калибрационнен разтвор (3.9.1), съдържащ 3,6 \mu\text{g}/\text{ml}, докато се постигнат постоянни височини на пика и времена на задържане. 5.4.2. Калибрационна графика Всеки от калибрационните разтвори, получени в (3.9.1), се инжектира няколко пъти и се измерват височините (областите на пика) за всяка концентрация. Начертава се калибрационна крива, като се обозначават средните пикови височини или области на калибрационните разтвори по ординатите, а съответните концентрации в \mu\text{g} за \text{ml} по абсцисите. 5.4.3. Мострен разтвор Мостреният разтвор се инжектира няколко пъти, като се използва същият обем като този в калибрационните разтвори и се определя средната пикова височина (област) на робенидиновите пикове. 6. Изчисление на резултатите От средната височина (област) на робенидиновите пикове се определя концентрацията на мострения разтвор в \mu\text{g}/\text{ml} на базата на калибрационната графика (5.4.2). Съдържанието на робенидин w (\text{mg}/\text{kg}) в пробата е дадена в следната формула: 200c W = \frac{\text{mg}}{\text{ml}} [\text{mg}/\text{kg}] където: с е концентрацията на робенидин в мострения разтвор в \mu\text{g}/\text{ml}; m – масата на тестовата позиция в g. 7. Потвърждаване на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използването на диоден детектор, с помощта на който могат да се сравнят спектрите на мострения екстракт и калибрационния разтвор (3.9.3), съдържащ 6 \mu\text{g}/\text{ml}. 7.1.1. Ко-хроматография Пробният екстракт се подсилва, като към него се прибави подходящо количество от калибрационния разтвор (3.9.3). Количеството добавен робенидин трябва да бъде сходно с количество робенидин, изчислено в пробния екстракт. Усилва се единствено височината на робенидиновия пик, като се вземе предвид както добавеното количество, така и разтвореният екстракт. Пиковата широчина в половината от максималната му височина трябва да бъде в приблизително 10% от началната широчина. 7.1.2. Диодно детектиране Резултатите са оценени съгласно следните критерии: (а) вълновата дължина на максималната абсорбция на пробата и стандартните спектри, регистрирана в пиковия апекс на хроматограмата, трябва да попадне в същото поле на разделителната сила на детектиращата система; що се отнася до диодния детектор, типично за него е да бъде приблизително в обсега на 2 nm; (б) в обсега между 250 и 400 nm пробата и стандартните спектри, регистрирани в пиковия апекс на хроматограмата, не трябва да се различават от онези части на спектъра, които попадат в обсег 10 до 100% от относителната абсорбция; критерият е изпълнен тогава, когато налице са същите максимуми и няма регистрирана точка, в която отклонението между двата спектъра да превишава 15% от абсорбцията на стандартния аналит; (в) в обсега между 250 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, апекса и низходящия наклон на пика, регистриран от мострения екстракт, не трябва да се различават един от друг за тези части от спектъра, които попадат в обсега на 10 до 100% от относителната абсорбция; критерият е спазен тогава, когато налице са същите максимуми и когато във всички регистрирани точки отклонението между спектрите не надминава 15% от абсорбцията на спектъра на апекса. Ако един от критериите не е спазен, наличието на аналита не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите от двата паралелно проведени опита за определяне на робенидиновото съдържание в една и съща проба не трябва да превишава 10% от по-високата стойност за робенидиново съдържание, по-голямо от 15 \text{mg}/\text{kg}. 7.3. Възстановяване Възстановяването за подсилена празна фуражна проба трябва да бъде поне 85%. 8. Резултати от съвместно изследване При организирано съвместно изследване, проведено от 12 лаборатории, при което предмет на анализ са четири фуражни проби от храната на домашни птици и зайци във формата на шрот или гранули, като всяка проба се подлага на двоен анализ, се получават следните резултати, представени в таблицата: Домашни птици Зайци шрот гранули шрот гранули Средна (mg/kg) 27,00 27,99 43,6 40,1 S_1 (mg/kg) 1,46 1,26 1,44 1,66 CV_1 (%) 5,4 4,5 3,3 4,1 S_1 (mg/kg) 4,36 3,36 4,61 3,91 CV_R (%) 16,1 12,0 10,6 9,7 Възстановяване (%) 90,0 93,3 87,2 80,2 S_1 – стандартно отклонение на повторяемост CV_1 – коефицент на вариация на повторяемостта S_R – стандартно отклонение на възпроизводимост CV_R – коефицент на вариация на възпроизводимостта XLII. Определяне на methyl benzoquate 7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone 1. Цели и обхват Този метод се използва за определяне съдържанието на methyl benzoquate във фуражите, като долната граница на определяне е 1 mg/kg. 2. Принцип Метиловият benzoquate се екстрахира от пробата с помощта на метанолова метаносулфонова киселина. Екстрактът се пречиства с дихлорметан чрез йоннообменна хроматография и после отново с дихлорметан. Съдържанието на метиловия benzoquate се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с много високи работни характеристики на базата на ултравиолетов детектор. 3. Реактиви 3.1. дихлорметан; 3.2. метанол, HPLC степен; 3.3. HPLC подвижна фаза: смесица от метанол (3.2) и вода (HPLC степен) 75+25 (v+v). Разтворът се прецежда през филтър 0,22 μm (4.5) и се дегазира (напр. чрез ултрасонификация в продължение на 10 min); 3.4. разтвор на метаносулфонова киселина, \sigma=2\% – метаносулфоновата киселина и метанолът се разреждат в съотношение 20 ml към 1000 ml (3.2); 3.5. разтвор на солна киселина, \sigma=10\% – солната киселина (P_{20} с, 1,18 g/ml) се разрежда с вода в съотношение 100 ml към 1000 ml; 3.6. катионнообменна смола Amberlite CG-120 (Na), 100 до 200 мрежа – смолата се подлага на обработка преди употреба – суспендират се 100 g от смолата и 500 ml разтвор на солна киселина (3.5), нагрява се на горещ котлон до завиране, като непрекъснато се бърка. Оставя се да се охлади и киселината се източва. Прецежда се през филтрова хартия във вакуум. Смолата първо се измива с 500 ml дози вода два пъти, а след това и с 250 ml метанол. Смолата се изплаква с още 250 ml метанол и се изсушава, като се пуска въздух през филтър-преса. Изсушената смола се съхранява в добре запушена бутилка; 3.7. стандартна субстанция – чист methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone); 3.7.1. Изходен стандартен разтвор на methyl benzoquate, 50 μg/ml – отмерват се 50 mg от стандартната субстанция (3.7) с точност до 0,1 mg и се разтварят в разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) в 100 ml градуирана колба. Допълва се до определената черта и се разбърква. 3.7.2. Междинен стандартен разтвор на methyl benzoquate, 500 μg/ml Прехвърлят се 5 ml от изходния стандартен разтвор на methyl benzoquate (3.7.1) в 50 ml градуирана колба. Допълва се с метанол (3.2) до определената черта и се разбърква. 3.7.3. Калибрационни разтвори Прехвърлят се 1, 2, 3, 4 и 5 ml от междинния стандартен разтвор на methyl benzoquate (3.7.2) в няколко 25 ml градуирани колби. Допълва се до определения за подвижната фаза (3.3) обем и се разбърква. Концентрацията на methyl benzoquate в тези разтвори е съответно 2, 4, 6, 8 и 10 μg/ml. Разтворите се приготвят непосредствено преди употреба. 4. Апаратура 4.1. лабораторен шейкър; 4.2. вакуумен ротационен изпарител на филма; 4.3. стъклена колона (250 mm x 15 mm), снабдена със запорен кран. Резервоарът е с обем 200 ml приблизително; 4.4. HPLC апарат с ултравиолетов детектор с променлива дължина на вълните или диоден детектор; 4.4.1. течна хроматографска колона – 300 mm x 4 mm, C_{18}, 10 m опаковка или еквивалент; 4.5. мембранни филтри, 0,22 μm; 5. Процедура 5.1. Общи положения 5.1.1. Анализира се празна фуражна проба с цел да се провери отсъствието както на methyl benzoquate, така и на интерфириращи вещества. 5.1.2. Провежда се възстановителен тест, като се анализира празната проба, която предварително е била усилена чрез прибавяне на допълнително количество methyl benzoquate, сходно с количеството в пробата. Пробата може да бъде усилена до ниво до 15 mg/kg, като се прибавят 600 μl от изходния стандартен разтвор (3.7.1) към 20 g от празната проба. Смесва се и се изчаква 10 min, преди да се продължи с етапа на екстракция (5.2). Забележка. За целите на метода празната проба трябва да бъде сходна по вид с образеца и при анализ не трябва да се открие наличието на methyl benzoquate. 5.2. Екстракция Отмерват се приблизително 20 g от приготвената проба до най-близкия 0,01 g и се прехвърлят в 250 ml конична колба. Прибавят се 100 ml разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) и се разбива механично в продължение на 30 min. Филтрира се през филтърна хартия и филтратът се запазва за етапа на разреждане течност – течност (5.3). 5.3. Разреждане течност – течност Прехвърлят се 100 ml солна киселина (3.5) и 250 ml от филтрата, получен в (5.2), в 500 ml делителна фуния. Прибавят се 100 ml дихлорметан (3.1) във фунията и се разбива за около 1 min. Оставят се пластовете да се разделят и се източва долният пласт (дихлорметан) в 500 ml колба с кръгло дъно. Екстракцията на водната фаза се повтаря с още две 40 ml дози дихлорметан и се смесва с първия екстракт от колбата с кръглото дъно. Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до изсъхване във вакуумния ротационен изпарител, работещ при намалено налягане и при 40 °C. Утайката се разтваря в 20 до 25 ml метанол (3.2), колбата се запушва и се запазва целият екстракт за йоннообменната хроматография (5.4). 5.4. Йоннообменна хроматография 5.4.1. Приготвяне на катионнообменната колона Запушва се долният край на стъклената колона (4.3) с тапа от стъклен памук. Приготвя се суспензия с 5 g от катионнообменно обработената смола (3.6) и 50 ml солна киселина (3.5). Тя се излива в стъклената колона и суспензията се оставя да се избистри. Източва се излишното количество киселина до нивото на повърхността на смолата и се промива колоната с вода, докато източеното вещество стане неутрално към лакмуса. Прехвърлят се 50 ml метанол (3.2) в колоната и се оставя да се отцеди до нивото на смолистата повърхност. 5.4.2. Колонна хроматография С помощта на пипета внимателно се прехвърля екстрактът, получен в (5.3), в колоната. Колбата с кръгло дъно се изплаква с две дози (от 5 до 10 ml) метанол (3.2) и изплакнатите количества се прехвърлят в колоната. Екстрактът се източва до нивото на смолата и колоната се измива с 50 ml метанол, като скоростта на изтичане е не по-голяма от 5 ml на min. Източеното количество се изхвърля. Methyl benzoquate от колоната се елюира, като се използва 150 ml разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) и се поставя колонният елюат в 250 ml конична колба. 5.5. Разреждане течност – течност Елюатът, получен в (5.4.2), се прехвърля в 11 делителна фуния. Коничната колба се изплаква с 5 до 10 ml метанол (3.2) и се смесват изплакнатите количества със съдържанието от делителната фуния. Прибавят се 300 ml разтвор на солна киселина и 130 ml дихлорметан (3.1). Разбива се за около 1 min и се оставя фазите да се разделят. Долният слой (дихлорметан) се източва в 500 ml колба с кръгло дъно. Екстракцията на водната фаза се повтаря с още две дози по 70 ml дихлорметан и се смесват новополучените екстракти с първия екстракт от колбата с кръгло дъно. Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до изсъхване във вакуумния ротационен изпарител, работещ при намалено налягане и при 40 °C. Утайката се разтваря в колбата с приблизително 5 ml метанол (3.2) и количествено разтворът се прехвърля в 10 ml градуирана колба. Колбата с кръгло дъно се изплаква с още две дози метанол (1 до 2 ml) и съдържанието се прехвърля в градуираната колба. Допълва се с метанол до определената черта и се разбърква. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (4.6). Разтворът се запазва за определяне на HPLC (5.6). 5.6. Определяне на HPLC 5.6.1. Параметри Предлагат се следните условия за провеждане на анализа: – течна хроматографична колона (4.4.1); – HPLC подвижна фаза – метанолово-водна смес (3.3); – скорост на изтичане – 1 до 1,5 ml/min; – вълнова дължина на детектора – 265 nm; – обем за инжектиране – 20 до 50 μl. Други условия могат да бъдат използвани, ако те дават равностойни резултати. Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се инжектира калибрационният разтвор (3.7.3), съдържащ 4μg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и времена на задържане. 5.6.2. Калибрационна графика Всеки от калибрационните разтвори, получени в (3.7.3), се инжектира няколко пъти и се измерват височините (областите) на пика за всяка концентрация. Начертава се калибрационна крива, като средните пикови височини или области на калибрационните разтвори се обозначават по ординатите, а съответните концентрации в μg за ml - по абсцисите. 5.6.3. Мострен разтвор Мостреният разтвор (5.5) се инжектира няколко пъти, като се използва същият обем като този в калибрационните разтвори и се определя средната пикова височина (област) на methyl benzoquate пикове. 6. Изчисление на резултатите От средната височина (област) на пиковете на methyl benzoquate се определя концентрацията на мострения разтвор в μg/ml, като се използва калибрационната графика (5.6.2). Съдържанието на methyl benzoquate w (mg/kg) в пробата е дадена в следната формула: 200c W = \frac{}{m} където: c е концентрацията на methyl benzoquate в мострения разтвор в μg/ml; m - масата на тестовата позиция в g. 7. Потвърждаване на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или чрез използване на диоден детектор, с помощта на който могат да се сравнят спектрите на мострения екстракт и калибрационния разтвор (3.7.3), съдържащ 10 μg/ml. 7.1.1. Ко-хроматография Пробният екстрат се подсилва, като към него се прибави подходящо количество от междинния стандартен разтвор (3.7.2). Количеството добавен methyl benzoquate трябва да бъде сходно с количество methyl benzoquate, изчислено в пробния екстракт. Усилва се единствено височината на methyl benzoquate пик, като се вземат предвид както добавеното количество, така и разтвореният екстракт. Пиковата широчина в половината от максималната му височина трябва да бъде в приблизително 10% от началната широчина. 7.1.2. Диодно детектиране Резултатите са оценени според следните критерии: (а) вълновата дължина на максималната абсорбция на пробата и стандартните спектри, регистрирана в пиковия апекс на хроматограмата, трябва да попадне в същото поле на разделителната сила на детектиращата система; типично за диодния детектор е да бъде приблизително в обсега на 2 nm; (б) в обсега между 250 и 400 nm пробата и стандартните спектри, регистрирани в пиковия апекс на хроматограмата, не трябва да се различават от онези части на спектъра, които попадат в обсег 10 до 100% от относителната абсорбция; критерият е изпълнен тогава, когато налице са същите максимуми и няма регистрирана точка, в която отклонението между двата спектъра да превишава 15% от абсорбцията на стандартния аналит; (в) в обсега между 250 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, апекса и низходящия наклон на пика, регистриран от мострения екстрат, не трябва да се различават един от друг за тези части от спектъра, които попадат в обсега на 10 до 100% относителна абсорбция; критерият е спазен тогава, когато налице са същите максимуми и когато във всички регистрирани точки отклонението между спектрите не надминава 15% от абсорбцията на спектъра на апекса. Ако един от критериите не е спазен, наличието на аналита не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите от двата паралелно проведени опита за определяне на methyl benzoquate съдържание в една и съща проба не трябва да превишава: 10% спрямо по-високата стойност на съдържание на methyl benzoquate, между 4 и 20 mg/kg. 7.3. Възстановяване Възстановяването за подсилена празна фуражна проба трябва да бъде поне 90%. 8. Резултати от съвместно изследване Пет проби се подлагат на анализ от 10 лаборатории. За всяка една проба са проведени двойни анализи. Резултатите са представени в таблицата: Празна проба Шрот 1 Гранули 1 Шрот 2 Гранули 2 Средна (mg/kg) n.d. 4,50 4,50 8,90 8,70 S_1 (mg/kg) n.d. 0,30 0,20 0,60 0,50 CV_1 (%) n.d. 6,70 4,40 6,70 5,70 S_1 (mg/kg) n.d. 0,40 0,50 0,90 5,70 CV_R (%) n.d. 8,90 11,00 10,10 11,00 Възстановяване (%) n.d. 92,00 93,00 92,00 89,00 n.d. - не е открито S_1 - стандартно отклонение на повторяемост CV_1 - коефицент на вариация на повторяемостта S_R - стандартно отклонение на възпроизводимост CV_R - коефицент на вариация на възпроизводимостта XLIII. Определяне на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар 1. Цел и обхват Методът е за определяне на спирамицин в животински храни и предварително приготвени смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ppm)(1). 2. Принцип Пробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при pH 8. Извлекът се декантира или центрофугира и разрежда. Нейната антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията на спирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зони на инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации. 3. Микроорганизъм - Microccus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553) 3.1. Поддържане на изходна култура В тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Microccus luteus и се слага в инкубатор за 24 h при 30 °C. Културата се съхранява в хладилник при около 4 °C. Слага се отново в инкубатор на всеки 2 седмици. 3.2. Приготвяне на бактериалната суспензия Взема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя в инкубатор за 18 – 20 h при 30 °C. Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква. Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъде около 75%, измерена при 650 nm в клетка 1 cm спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °C. 4. Културална среда и реактиви 4.1. Културална среда Месен пептон 6 g Триптон 4 g Екстракт от дрожди 3 g Месен екстракт 1,5 g Гликоза 1 g Агар-агар 10 до 20 g Вода 1000 ml pH 6,5 до 6,6 (след стерилизация). 4.2. Хранителна среда за извършване на анализа Триптон 5 g Екстракт от дрожди 4 g Месен екстракт 3 g Агар-агар 10 до 20 g Вода 1000 ml pH 8,0 (след стерилизация). 4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8% (об.т.) Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml и се стерилизира. Двукалиев водороден фосфат K_2HPO_4 16,7 g Калиев двуводороден фосфат KH_2PO_4 0,5 g Натриев водороден карбонат NaHCO_3 20 g Вода до 1000 ml 4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4) 50/50 об. тегло 4.6. Стандартна субстанция Спирамицин с известна активност (в IU). 5. Стандартни разтвори Разтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °C, този разтвор е стабилен до 5 дни. От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори: S_8 - 1 \text{ IU/ml} S_4 - 0,5 \text{ IU/ml} S_2 - 0,25 \text{ IU/ml} 6. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ 6.1. Извличане Претегля се проба от 20 g при животински храни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира и плаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U_8). За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg животинска храна, извличането се извършва, както следва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min; центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряват до около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40 °C. Остатъкът се разрежда със сместа (4.5), за да се очаква съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U_8). 6.2. Разтвори за извършване на анализ От разтвор U_8 се приготвят разтвори U_4 (очаквано съдържание: 0,5 IU/ml), U_2 (очаквано съдържание: 0,25 IU/ml) и U_1 (очаквано съдържание: 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1+1) със сместа (4.5). 7. Процедура на извършване на анализа 7.1. Посяване в средата за изпитване В средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °C. Чрез предварителни опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо да се получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин. 7.2. Подготовка на петритата Дифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S_8, S_4, S_2 и S_1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U_8, U_4, U_2 и U_1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита, достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит с алуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm. В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60 ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точно премерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32 зони на инхибиране. 7.3. Поставяне в инкубатор Петритата се поставят за 16 – 18 h при 30 \pm 2 \text{ } ^\circ\text{C}. 8. Оценяване Измерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма на концентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствие на стандартния разтвор и екстракта. Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използва формулата: SL = \frac{7S_1 + 4S_2 + S_4 - S_8}{10} \quad (1) Определя се „най-точно съответстващата“ точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използва формулата: SH = \frac{7S_8 + 4S_4 + S_2 - S_1}{10} \quad (2) По подобен начин се изчисляват и „най-точно съответстващите“ точки за най-ниските нива на екстракта (UL) и най-високите нива на екстракта (UH) като във формулите се заменят S_1, S_2 и S_8 с U_1, U_4 и U_8. Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за да се получи линията на „най-точно съответствие“ за екстракта. При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат да се считат паралелни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10% от тяхната средна аритметична стойност. Ако се окаже, че линиите не са паралелни u_1 и s_1 или u_8 и s_8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да се изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на „най-точно съответствие“ SL = \frac{5S_1 + 2S_2 - S_4}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_2 + 2S_4 - S_8}{6} \quad (3) SH = \frac{5S_4 + 2S_2 - S_1}{6} \quad \text{или} \quad \frac{5S_8 + 2S_4 - S_2}{6} \quad (4) и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет. Малките букви „s“ и „u“ се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране. Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (\log A) посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка на успоредността. \text{За четири нива –} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 + U_8 - S_1 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,602}{U_4 + U_8 + S_4 + S_8 - U_1 - U_2 - S_1 - S_2} \quad (5) \text{За три нива –} Log A = \frac{(U_1 + U_2 + U_4 - S_1 - S_2 - S_4) \cdot 0,401}{U_4 + S_4 - U_1 - S_1} \quad (6) \text{или} Log A = \frac{(U_2 + U_4 + U_8 - S_2 - S_4 - S_8) \cdot 0,401}{U_8 + S_8 - U_2 - S_2} \quad (7) Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по A: (U_8 = S_8 \times A) Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно – на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет. Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтаря. Ако пак не може да се получи успоредност, определянето се счита за незадоволително. Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg животинска храна. 9. Повторяемост Разликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия лаборант, не трябва да превишава: – 2 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg; – 20% от най-високата стойност – за съдържания от 10 до 25 mg/kg; – 5 mg/kg в абсолютна стойност – за съдържание от 25 до 50 mg/kg; – 10% от най-високата стойност – за съдържания над 50 mg/kg. XLIV. Определяне на диклазурил (+) – 4-хлорфенил [2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил] ацетонитрил 1. Цели и обхват Това е метод за определяне на диклазурил в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване е 0,1 mg/kg. Границата на определяне е 0,5 mg/kg 2. Принцип След добавяне на вътрешен еталон пробата се извлича с подкиселен метанол. При животински храни аликватната част на екстракта се пречиства в екстракционен патрон C18 твърда фаза. Диклазурилът се отмива от патрона със смес от подкиселен метанол и вода. След изпаряване остатъкът се разтваря в DMF/вода. При предварително приготвени смеси екстрактът се изпарява и остатъкът се разтваря в DMF/вода. Съдържанието на диклазурил се определя чрез течна хроматография троичен градиент обратна фаза (HPLC) с използване на УВ детектор. 3. Реагенти 3.1. вода, клас HPLC; 3.2. амониев ацетат; 3.3. тетрабутиламониев водороден сулфат (TBHS); 3.4. ацетонитрил, клас HPLC; 3.5. метанол, клас HPLC; 3.6. N,N-диметилформамид (DMF); 3.7. солна киселина \rho_{20} = 1,19 \text{ g/ml}; 3.8. еталонна субстанция: ампролиум II-24 - (+) – 4-хлорфенил [2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил] ацетонитрил с гарантирана чистота, E 771. 3.8.1. Изходен еталонен разтвор на диклазурил, 500 \mu\text{g/ml} Претеглят се с точност 0,1 mg 25 mg от еталонната субстанция на диклазурил (3.8) в мерителна колба от 50 ml, разтварят се в DMF (3.6), допълва се до отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец. 3.8.2. Еталонен разтвор на диклазурил, 50 µg/ml 5 ml от изходния еталонен разтвор (3.8.1) се прехвърлят в мерителна колба 50 ml, долива се с DMF до отметката (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на 1 месец. 3.9. Вътрешна еталонна субстанция: 2,6-дихлоро-\alpha-(4-хлорфенил)-4-(4,4 дихидро3,5 диоксо-1,2,4-триазин-2 (3H)-yl) \alpha-метилбензин-ацетонитрил. 3.9.1. Вътрешен изходен еталонен разтвор, 500 µg/ml Претеглят се с точност 0,1 mg 25 mg от вътрешната еталонна субстанция (3.9) в мерителна колба 50 ml. Разтваря се в DMF (3.6), долива се до отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец. 3.9.2. Вътрешен еталонен разтвор, 50 µg/ml 5,00 ml от вътрешния изходен еталонен разтвор се прехвърлят (3.9.1) в мерителна колба 50 ml, долива се до отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец. 3.9.3. Претеглят се с точност 0,1 mg p/210 mg от вътрешната еталонна субстанция в мерителна колба 100 ml, разтваря се в DMF (3.6) в ултразвукова вана (4.6), долива се до отметката с DMF и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 °C разтворът е стабилен в продължение на един месец. 3.10. Калибриращ разтвор, 2 µg/ml Отпипетирват се 2 ml еталонен разтвор на диклазурил (3.8.2) и 2,00 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2) в мерителна колба от 50 ml. Добавят се 16 ml DMF (3.6), долива се до отметката с вода и се смесва. Този разтвор се приготвя непосредствено преди използване. 3.11. Екстракционен патрон C18 твърда фаза, напр. Bond Elut, размер 1 cc, маса на сорбента 100 mg 3.12. Екстракционен разтворител – подкиселен метанол Отпипетирват се 5 mg солна киселина (3.7) в 1000 mg метанол (3.5) и се смесват. 3.13. Мобилна фаза за HPLC Отмиващ агент A – амониев ацетат – разтвор на тетрабутиламониев водороден сулфат. 3.13.1. 5 g амониев ацетат (3.2) и 3,4 g TBSH се разтварят (3.3) в 1000 ml вода (3.1) и се смесват. 3.13.2. Отмиващ агент Б – ацетонитрил (3.4). 3.13.3. Отмиващ агент В – метанол (3.5). 4. Апарати 4.1. механичен вибратор; 4.2. оборудване за HPLC троичен градиент; 4.2.1. течна хроматографска колона, Hypersil ODS, пълнеж 3 µm, 100 mm × 4,6 mm или еквивалентна; 4.2.2. УВ детектор с регулиране на дължината на вълната или диоден полеви детектор; 4.3. вакуумен ротационен изпарител; 4.4. мембранен филтър, 0,45 µm; 4.5. вакуумен колектор; 4.6. ултразвукова вана. 5. Процедура 5.1. Общи положения 5.1.1. Празна проба храна Анализира се празна проба храна, за да се провери отсъствието на диклазурил и на субстанции, които оказват влияние. Празната проба храна трябва е подобна по вид на пробата и/или субстанциите, които оказват въздействие. 5.1.2. Тест за възстановяване Извършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било добавено количество диклазурил, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 1 mg/kg, 0,1 ml от изходния еталонен разтвор (3.8.1) се добавят към 50 g празна проба храна, смесва се добре и се оставя за 10 min, като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2). Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът на възстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да се анализира, се подсилва с количество диклазурил подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба се анализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане. 5.2. Екстракция 5.2.1. Животински храни С точност до 0,01 g се претеглят приблизително 50 g от пробата. Прехвърлят се в ерленмайерова колба от 500 ml, прибавят се 1 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2), 200 ml екстракционен разтворител (3.12) и колбата се запушва. Сместа се разтръсква на вибратора (4.1) цяла нощ. Оставят се да се утаи 10 min. 20 ml от аликвотната част на слоя, плаващ отгоре, се прехвърлят в подходящ стъклен контейнер и се разреждат с 20 ml вода. Този разтвор се прехвърля в екстракционен патрон (3.11) и минава през него чрез прилагане на вакуум (4.5). Патронът се измива с 25 ml смес на екстракционния разтворител (3.12) и вода, 65 + 65 (V + V). Отстраняват се събраните фракции и съединенията се отмиват с 25 ml смес на екстракционния разтворител (3.12) и вода, 80 + 20 (V + V). Тези фракции се изпаряват точно до постигане на сухост с помощта на ротационен изпарител (4.3) при температура 60 °C. Остатъкът се разрежда в 1 ml DMF (3.6), добавят се 1,5 ml вода и се смесват. Филтрира се през мембранен филтър (4.4). Продължава се с определяне с помощта на HPCL (5.3). 5.2.2. Предварително приготвени смеси С точност до 0,001 g се претегля приблизително 1 g от пробата. Прехвърля се в ерленмайерова колба от 500 ml, прибавят се 1,00 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2), 200 ml екстракционен разтворител (3.12) и колбата се запушва. Сместа се разтръсква на вибратора (4.1) цяла нощ. Оставя се да се утаи 10 min. Аликвотна част 10.000/p ml (р е номиналното съдържание на диклазурил в предварително приготвената смес в mg/kg) на плаващия отгоре слой в облодънна колба с подходящ размер. Изпарява се точно до постигане на сухост с помощта на ротационен изпарител (4.3) под редуцирано налягане при температура 60 °C. Остатъкът се разрежда отново в 10 ml DMF (3.6), добавят се 15 ml вода и се смесват. Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3). 5.3. Определяне с HPLC 5.3.1. Параметри Следните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако те дават еквивалентни резултати. Течна хроматографична колона (4.2.1) 100mm × 4,6, Hypersil ODS, 3 µm опакован или еквивалент Подвижна фаза Eluent A (3.13.1): воден разтвор от амониев ацетат и тетрабутил - амониев хидроген сулфат Eluent A (3.13.2): ацетонитрил Eluent A (3.13.3): метанол Състояние на елюация Линеен градиент Първоначални условия: A+B+C = 60 + 20 + 20 (v+v+v) След 10min градиентна елюация за 30 min до: A+B+C = 45 + 20 + 35 (v+v+v) Промиване с B 10 min Скорост на изтичане 1,5 – 2 ml/min. Обем на вливане 20 µl Дължина на вълната 280 nm Стабилността на хроматографската система се проверява, като се инжектира няколко пъти калибриращият разтвор (3.10), съдържащ 1,0µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне. 5.3.2. Калибрираща графика 20 µl калибриращ разтвор се инжектират (3.7.3) няколко пъти и се определя средноаритметичната височина (площ) на пиковете на диклазурил и на пиковете на вътрешните еталони. 5.3.3. Разтвор на пробата 20 µl разтвор на пробата се инжектира (5.2.1 или 5.2.2) няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете и на пиковете на вътрешните еталони. 6. Изчисляване на резултатите 6.1. Храни Съдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се дава със следната формула: w = \frac{\text{hd,s.hi,c}}{\text{hi,s.hd,c}} \cdot \frac{\text{βd,c.10V}}{\text{m}} [\text{mg/kg}], където: hd,s е височината (площта) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (5.2.1); hi,s – височината (площта) на пика на вътрешния еталон в разтвора на пробата (5.2.1); hd,c – височината (площта) на пика на диклазурил в калибриращия разтвор (3.10); hi,c – височината (площта) на пика на вътрешния еталон в калибриращия разтвор (3.10); βd,c – концентрацията на диклазурил в калибриращия разтвор в µg/ml; m – масата на изпитваната част в [g]; V – обемът на екстракта пробата съгласно 5.2.1 (т.е. 2,5 ml). 6.2. Предварително приготвени смеси Съдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се определя със следната формула: w = \frac{\text{hd,s.hi,c}}{\text{hi,s.hd,c}} \cdot \frac{\text{βd,c.0,02.Vp}}{\text{m}} [\text{mg/kg}], където: hd,s е височината (площта) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (5.2.2); hi,s – височината (площта) на пика на вътрешния еталон в разтвора на пробата (5.2.1); hd,c – височината (площта) на пика на диклазурил в калибриращия разтвор (3.10); hi,c – височината (площта) на пика на вътрешния еталон в калибриращия разтвор (3.10); βd,c – концентрация на диклазурил в калибриращия разтвор в µg/ml; m – масата на изпитваната част в [g]; V – обемът на екстракта пробата съгласно 5.2.2 (т.е. 2,5 ml). 7. Установяване на достоверността на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2.1 или 5.2.2) и на калибриращия разтвор (3.10). 7.1.1. Ко-хроматография Екстракт на пробата (5.2.1 или 5.2.2) се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3.10). Количеството на добавения диклазурил трябва да бъде подобно на количеството диклазурил, открито в екстракта на пробата. Само височината на пика на диклазурил трябва да се увеличи, след като се вземат предвид добавеното количество и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъде в рамките на \pm 10\% от оригиналната широчина на пика на диклазурил на неподсилен екстракт на разтвора. 7.1.2. Диодна полева детекция Резултатите се оценяват съгласно следните критерии: (а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена от разрешаващата способност на системата за детекция; за диодната детекция тя типично е в рамките на \pm 2 nm; (б) между 230 и 320 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика на хроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени в обхвата 10 – 100 %, от относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра на еталонния аналит; (в) между 230 и 320 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика, произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра във връхната точка на пика. Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава: – 30 % от най-високия резултат – за съдържание на диклазурил между 0,5 mg/kg и 2,5 mg/kg; – 0,75 mg/kg – за съдържание на диклазурил между 2,5 mg/kg и 5 mg/kg; – 15 % от най-високия резултат – за съдържание на диклазурил над 5 mg/kg. 7.3. Възстановяване За една подсилена (празна) проба възстановяването трябва да бъде най-малко 80 %. 8. Резултати от съвместното изследване При анализа на пет мостри (тези проби включват 2 предварително приготвени смеси – едната, смесена с органична матрица (O 100), а другата – с неорганична матрица (A 100). Теоретичното съдържание е 100 mg диклазурил на kg. Двете смесени храни за птици са произведени от 3 различни производители (NL) (L1/Z1/K1). Теоретичното съдържание е 1 mg диклазурил на kg. Лабораториите са инструктирани да анализират всяка проба един или два пъти.) от 11 лаборатории се получават следните резултати, дадени в долната таблица: Пример 1 A 100 Пример 2 O 100 Пример 3 L 100 Пример 4 Z 1 Пример 5 K 1 L 11 11 11 11 6 n 19 18 19 19 12 mean 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89 S_r (mg/kg) 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 CV_r (%) 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34 S_R (mg/kg) 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 CV_R (%) 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65 Номинално съдържание 100 100 1 1 1 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; S_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост. 9. Забележка. Трябва предварително да бъде показано, че реакцията на диклазурил в обхвата на концентрациите е линейна. XLV. Определяне на карбадокс Метил 3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1,N4-диоксид 1. Цели и обхват Това е метод за определяне на карбадокс в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване е 1 mg/kg; границата на определяне е 10 mg/kg. 2. Принцип Пробата се уравновесява с вода и се извлича с метанол-ацетонитрил. При животинските храни аликватна част на филтрирания екстракт се подлага на почистване в алуминиева оксидна колона. При предварително приготвените смеси и препарати аликватна част от филтрирания екстракт се разрежда до подходяща концентрация с вода, метанол и ацетонитрил. Съдържанието на карбадокс се определя с помощта на висококачествена течна хроматография обратна фаза, като се използва УВ детектор. 3. Реагенти 3.1. метанол; 3.2. ацетонитрил, HPLC клас; 3.3. оцетна киселина, w = 100\%; 3.4. алуминиев оксид: неутрален, клас активност = I.; 3.5. метанол-ацетонитрил (1 + 1) (v + v) – смесват се 500 ml метанол (3.1) с 500 ml ацетонитрил (3.2); 3.6. оцетна киселина, \sigma = 10\% – разреждат се 10 ml оцетна киселина (3.3) до 100 ml с вода; 3.7. натриев ацетат, CH_3COONa; 3.8. вода, клас HPLC; 3.9. ацетатен буферен разтвор, c = 0,01 \text{ mol/l}, \text{pH} = 6,0 - 0,82 \text{ g} натриев ацетат се разтварят (3.7) в 700 ml вода (3.8) и се коригира стойността на \text{pH} до 6 с оцетна киселина (6.3). Прехвърля се в мерителна колба от 1000 ml, долива се до отметката вода (3.6) и се смесва. 3.10. Мобилна фаза за HPLC. Смесват се 825 ml разтвор на ацетатен буфер (3.9) със 175 ml ацетонитрил (3.2). Филтрира се през филтър 0,22\mu\text{m} (4.5) и разтворът се дегазира (напр. чрез ултразвукова обработка в продължение на 10 min). 3.11. Еталонна субстанция Чист карбадокс – метил 3-(2-хиноксалинил-метилен) карбазат N1,N4-диоксид, E 850. 3.11.1. Изходен еталонен разтвор на карбадокс, 100 \mu\text{g/ml} (вж. т. 5 Процедура) С точност до 0,1 mg се претеглят 25 mg еталонна субстанция карбадокс (3.11) в мерителна колба от 250 ml. Разтваря се в метанол-ацетонитрил (3.5) в ултразвукова вана (4.7). След ултразвуковото третиране разтворът се довежда до стайна температура, долива се до отметката с метанол-ацетонитрил (3.5) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4 ^{\circ}\text{C} разтворът е стабилен в продължение на един месец. 3.11.2. Калибриращи разтвори 2, 5, 10 и 20 ml от изходния еталонен разтвор се прехвърлят (3.11.1) в няколко калибрирани колби от 100 ml. Добавят се 30 ml вода, добавя се до отметката метанол-ацетонитрил (3.5) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио. Тези разтвори отговарят съответно на 2, 5, 10 и 20 \mu\text{g/ml} карбадокс. Калибриращите разтвори се приготвят непосредствено преди употреба. Забележка. За определяне на карбадокс в животински храни, съдържащи по-малко от 10 mg/kg, се приготвят калибриращи разтвори с концентрация под 2,0 \mu\text{g/ml}. 3.12. Смес вода-[метанол-ацетонитрил] (3.5), 300 + 700 (v + v) Смесват се 300 ml вода със 700 ml смес на метанол-ацетонитрил (3.5). 4. Апарати 4.1. лабораторен вибратор или магнитна бъркалка; 4.2. стъклено влакнеста филтърна хартия (Whatman GF/A или еквивалентен); 4.3. стъклена колона (дължина 300 до 400 mm, вътрешен диаметър приблизително 10 mm) със синтерована стъклена фрита и отвеждащ клапан. Забележка. Могат да бъдат използвани също стъклена колона със спирателен кран или стъклена колона с конусен край. В този случай в долния край се слага тапа от стъклена вата и се уплътнява с помощта на стъклена пречка. 4.4. HPLC оборудване с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 20 \mu\text{l}; 4.4.1 течна хроматографска колона: 300 mm \times 4 mm, \text{C}_{18}, 10 \mu\text{m} пълнеж или еквивалентна; 4.4.2. УВ детектор с регулиране на дължината на вълната или диоден полеви детектор, работещи в обхвата 225 – 400 nm; 4.4. мембранен филтър, 0,22 \mu\text{m}; 4.5. мембранен филтър, 0,45 \mu\text{m}; 4.6. ултразвукова вана. 5. Процедура Забележка. Карбадоксът е чувствителен на светлина. Всички процедури се извършват при намалена светлина или се използват тъмни стъкленици или стъкленици, увити в алуминиево фолио. 5.1. Общи положения 5.1.1. Празна проба храна За осъществяване на теста на възстановяване (5.1.2) се анализира празна проба храна, за да се провери отсъствието на карбадокс и на субстанции, които оказват влияние. Празната проба храна трябва да бъде подобна по вид на пробата и при анализа не трябва да се открият карбадокс или субстанции, които оказват въздействие. 5.1.2. Тест за възстановяване Извършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, която е била подсилена чрез добавяне на количество карбадокс, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 50 mg/kg, 15 ml от изходния еталонен разтвор (3.11.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба от 200 ml и разтворът се изпарява в азотен поток до около 0,5 ml. Прибавят се 10 g от празната проба храна, разбърква се добре и се оставя за 10 min, като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2). Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът на възстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да се анализира, се подсилва с количество карбадокс, подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба се анализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане. 5.2. Екстракция 5.2.1. Животински храни С точност до 0,01 g се претеглят приблизително 10 g от пробата и се прехвърлят в ерленмайерова колба от 200 ml. Добавят се 15 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 35 ml метанол-ацетонитрил (3.5), слага се запушалка и се разтръсква в продължение на 30 min на вибратора или се разбърква с магнитната бъркалка (4.1). Разтворът се филтрира през стъклено влакнеста филтърна хартия (4.2). Този разтвор се запазва за етапа на пречистване (5.3). 5.2.2. Предварително приготвени смеси (0,1 до 2% ампролиум) и животински храни С точност до 0,01 g се претегля приблизително 1 g от несмляната проба и се прехвърля в ерленмайерова колба от 200 ml. Добавят се 15 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 35 ml метанол-ацетонитрил (3.5), слага се запушалка и се разтръсква в продължение на 30 min на вибратора или се разбърка с магнитната бъркалка (4.1). Разтворът се филтрира през стъклено влакнеста филтърна хартия (4.2). Отпипетирва се аликвотна част на филтрата в калибрирана колба от 50 ml. Добавят се 15 ml вода, долива се до отметката метанол-ацетонитрил (3.5) и се смесва. Концентрацията на карбадокс в крайния разтвор трябва да бъде приблизително 10 \mu\text{g}/\text{ml}. Аликвотът се филтрира през филтър 0,45\mu\text{m} (4.6). (4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.4). 5.2.3. Препарати (> 2\%) С точност до 0,001 g се претеглят приблизително 0,2 g от несмляната проба и се прехвърлят в ерленмайерова колба от 250 ml. Добавят се 45 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 105 ml метанол-ацетонитрил (3.5), поставя се запушалка и се хомогенизира. Пробата се поставя в ултразвукова вана (4.7) за 15 min, след което се разтръсква или разбърква (4.1) в продължение на 15 min. Разтворът се филтрира през стъклено влакнеста филтърна хартия (4.2). Аликвотът на филтрата се разрежда със смес вода-метанол-ацетонитрил (3.12) до концентрация на карбадокс в крайния разтвор 10 – 15\mu\text{g}/\text{ml} (за препарат 10% коефициентът на разреждане е 10). Аликвотът се филтрира през филтър 0,45 \mu\text{m} (4.6). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.4). 5.3. Пречистване 5.3.1. Подготовка на алуминиевата оксидна колона Претеглят се 4 g алуминиев оксид (3.4) и се прехвърлят в стъклената колона (4.3). 5.3.2. Пречистване на пробата 15 ml филтриран екстракт се подават (5.2.1) в алуминиевата оксидна колона и се отстраняват първите 2 ml от отмиващия агент. Следващите 5 ml се събират и аликвотът се филтрира през филтър 0,45 \mu\text{m} (4.6). Преминава се към определяне с помощта на HPLC (5.4) 5.4. Определяне с HPLC 5.4.1. Параметри Следните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако дават еквивалентни резултати. Течна хроматографична колона (4.1.1) – 300 mm × 4 mm, C_{18}, 10\mu\text{m} опаковка или еквивалент. Подвижна фаза (3.10) – смес от ацетатен буферен разтвор (3.9) и ацетонитрил (3.2.), 825 + 175 (v+v). Скорост на изтичане – 1,5 – 2 ml/min Дължина на вълната – 365 nm Обем за инжектиране – 20 \mu\text{l}. Стабилността на хроматографската система се проверява, като калибриращият разтвор (3.11.3), съдържащ 5 \mu\text{g}/\text{ml}, се инжектира няколко пъти, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне. 5.4.2. Калибрираща графика Няколко пъти се инжектира калибриращ разтвор (3.11.3) и се определят средноаритметичните височини (площ) на пиковете за всяка концентрация. Начертава се калибриращата графика, като се използват средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответните концентрации в \mu\text{g}/\text{ml} за абсциси. 5.4.3. Разтвор на пробата Екстракт от пробата [(5.3.2) за животински храни, (5.2.2) за предварително приготвени смеси, (5.2.3) за препарати] се инжектира няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете на карбадокс. 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площи) на пиковете на карбадокс на разтвора на пробата се определя концентрацията на разтвора на пробата в \mu\text{g}/\text{ml} чрез сравняване с калибриращата графика (5.4.2). 6.1. Животински храни Съдържанието на карбадокс w в mg/kg в пробата се дава със следната формула: w = \frac{b \cdot V_1}{m} [\text{mg}/\text{kg}], където: b е концентрацията на карбадокс в екстракта от пробата (5.3.2) в \mu\text{g}/\text{ml}; V_1 – обемът на екстракта в ml (т.е. 50 ml); m – теглото на изследваната част в [g]. 6.2. Предварително приготвени смеси и препарати Съдържанието на карбадокс w в mg/kg в пробата се дава със следната формула: w = \frac{b \cdot V_2 f}{m} [\text{mg}/\text{kg}], където: b е концентрацията на карбадокс в екстракта от пробата (5.2.2 или 5.2.3) в \mu\text{g}/\text{ml}; V_2 – обемът на екстракта в ml (т.е. 50 за предварително приготвени смеси и 150 – за препарати); f – коефициент на разреждане съгласно 5.2.2 (предварително приготвени смеси) или 5.2.3 (препарати); m – теглото на изследваната част в g. 7. Установяване на достоверността на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибриращия разтвор (3.11.3), съдържащ 10 \mu\text{g}/\text{ml}. 7.1.1. Ко-хроматография Екстракт на пробата се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3.11.3). Количеството на добавения карбадокс трябва да бъде подобно на количеството карбадокс, открито в екстракта на пробата. Само височината на пика на карбадокс трябва да се увеличи, след като се вземат предвид добавеното количество и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъде приблизително 10% от оригиналната широчина на пика на карбадокс на неподсилен екстракт на разтвора. 7.1.2. Диодна полева детекция Резултатите се оценяват съгласно следните критерии: (а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена от разрешаващата способност на системата за детекция; за диодната детекция тя типично е в рамките на \pm 2 nm; (б) между 225 и 400 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика на хроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 %, от относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от оптична плътност на спектъра на еталонния аналит; (в) между 225 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика, произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра във връхната точка на пика. Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава. 7.2. Повторяемост За съдържания 10 mg/kg или по-високи разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава 15% спрямо най-високия резултат. 7.3. Възстановяване За една подсилена (празна) проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от съвместното изследване При анализиране на шест животински храни, четири предварително приготвени смеси и три препарата (на всяка проба бяха извършени дублирани анализи) от 8 лаборатории се получават резултатите (с изключение на различаващите се от нормалните стойности), дадени в следната таблица: Таблица 1. Резултати от съвместното изследване на животински храни Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5 Проба 6 L 8 8 8 8 8 8 N 15 14 15 15 15 15 Средна (mg/kg) 50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7 Sr (mg/kg) 2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12 CVr (%) 5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3 SR (mg/kg) 3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44 CVR (%) 7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9 Номинално 50,0 съдържание (mg/kg) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 Таблица 2. Резултати от съвместното изследване на предварително приготвени смеси и препарати Предварително приготвени смеси Препарати A B C D A B C L 7 7 7 7 8 8 8 N 14 14 14 14 16 16 16 Средна (g/kg) 8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104 Sr (g/kg) 0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7 CVr (%) 4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4 SR (g/kg) 0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7 CVR (%) 4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4 Номинално съдържание (g/kg) 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; Sr – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVr – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVI. Определяне на витамин A 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на витамин A (ретинол) в животински храни и предварително приготвени смеси. Витамин A включва всички транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери, които се определят по този метод. Съдържанието на витамин A се изразява в международни единици (IU) на kg. Една IU отговаря на активността на 0,300 µg от всички транс-витамин A алкохоли или на 0,344 µg от всички транс-витамин A ацетати или 0,550 µg от всички транс-витамин A палмитати. Границата на определяне е 2000 IU витамин A/kg. 2. Принцип Пробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин A се извлича в петролен етер. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин A се определя чрез висококачествена течна хроматография обратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор. Хроматографските параметри се избират, така че да няма разделяне между всичките транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери. 3. Реагенти 3.1. етанол, \sigma = 96\%; 3.2. лек петролен етер, обхват на кипене 40 ° до 60 ° C; 3.3. метанол; 3.4. разтвор на калиев хидроксид, \mu/100 ml; 3.5. разтвор на натриев аскорбат, \beta = 10 g/100 ml (вж. 7.7 забележки); 3.6. натриев сулфид, \text{Na}_2\text{S.xH}_2\text{O} (x = 7 - 9); 3.6.1. разтвор на натриев сулфид, c = 0,5 \text{ mol/l} в глицерол, \beta = 120 \text{ g/l} (за x = 9) (вж. 7.8 забележки); 3.7. фенолфталеинов разтвор, \beta = 2 \text{ g/100 ml} в етанол (3.1); 3.8. 2-пропанол; 3.9. мобилна фаза за HPLC: смес на метанол (3.3) и вода, напр. 980 + 20 (V + V). Точното съотношение се определя от характеристиките на използваната колона; 3.10. азот, без съдържание на кислород; 3.11. всички транс-витамин A ацетати, свръхчисти, със сертифицирана активност, напр. 2,80 \times 106 \text{ IU/g}; 3.11.1. Изходен разтвор на всички транс-витамин A ацетати: с точност до 0,1 \text{ mg} се претеглят 50 \text{ mg} ацетат на витамин A (3.11) в мерителна колба 100 \text{ ml}. Разтварят се в 2-пропанол (3.8) и със същия разтворител се долива до марката. Номиналната концентрация на този разтвор е 1400 \text{ IU} витамин A на \text{ml}. Точното съдържание трябва да се определи съгласно 5.6.3.1; 3.12. всички транс-витамин A палмитати, свръхчисти, със сертифицирана активност, напр. 1,80 \times 106 \text{ IU/g}; 3.12.1. изходен разтвор на всички транс-витамин A палмитати: с точност до 0,1 \text{ mg} се претеглят 80 \text{ mg} палмитат на витамин A (3.12) в мерителна колба 100 \text{ ml}. Разтварят се в 2-пропанол (3.8) и се долива до отметката със същия разтворител. Номиналната концентрация на този разтвор е 1400 \text{ IU} витамин A на \text{ml}. Точното съдържание трябва да се определи съгласно 5.6.3.2. 3.13. 2,6-ди-терт-бутил-4метилфенол (ВНТ) (вж. 7.5 забележки) 4. Апаратура 4.1. вакуумен ротационен изпарител; 4.2. стъклария от тъмно стъкло; 4.2.1. плоскодънни или ерленмайерови колби, 500 \text{ ml}, със загладен разширен край; 4.2.2. мерителни колби с плоски запушалки, тясно гърло, 10, 25, 100 и 500 \text{ ml}; 4.2.3. разделящи фунии, конични, 1000 \text{ ml}, със загладени стъклени запушалки; 4.2.4. крушовидни колби, 250 \text{ ml}, със загладени стъклени запушалки; 4.3. хладник на Allihn, дължина на ризата 300 \text{ mm}, със загладен свързващ елемент, с адаптер за подаващата газ тръба; 4.4. нагъната филтърна хартия за разделяне на фазите, диаметър 185 \text{ mm} (напр. Schleicher & Schuell 597 HY ½); 4.5. HPLC оборудване с инжекционна система; 4.5.1. течна хроматографска колона, 250 \text{ mm} \times 4 \text{ mm}, C_{18}, 5 или 10 \mu\text{m} пълнеж или еквивалентна (изискване към качеството на работа: само единичен пик за всички изомери на ретинола при условията на HPLC); 4.5.2. УВ или флуоресцентен детектор, с регулиране дължината на вълната; 4.6. спектрофотометър с кварцови клетки 10 \text{ mm}; 4.7. водна вана с магнитна бъркалка; Фиг. 1. Екстракционен апарат (4.8) 4.8. екстракционен апарат (вж. фигурата), състоящ се от: 4.8.1. стъклен цилиндър с обем 1 \text{ l}, снабден със загладено стъклено гърло и запушалка; 4.8.2. загладена стъклена вложка със странично рамо и регулируема тръба, минаваща през центъра. Регулируемата тръба трябва да има долен край с U-форма и дюза на противоположния край, така че горният течен слой в цилиндъра да може да се прехвърля в разделяща фуния. 5. Процедура Забележка. Витамин A е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиево фолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва се излишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време). 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се смила така, че да минава през мрежесто сито с отвори 1 \text{ mm}, като се внимава да се избягва генерирането на топлина. Смилането се извършва непосредствено преди претеглянето и осапуняването. В противен случай може да има загуби на витамин A. 5.2. Осапуняване В зависимост от съдържанието на витамин A с точност до 0,01 \text{ g} се претеглят от 2 до 25 \text{ g} от пробата в плоскодънна или ерленмайерова колба 500 \text{ ml} (4.2.1). Последователно със завихряне се добавят 130 \text{ ml} етанол (3.1), приблизително 100 mg BHT (3.13), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид (3.6). Хладникът се свързва (4.3) към колбата и тя се потапя във водна вана с магнитна бъркалка (4.7). Загрява се до кипене и се оставя да се нагрее с обратен хладник за 5 min. След това се добавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид (3.4) през хладника (4.3) и се оставя да се нагрее с обратен хладник за още 25 min, като се разбърква под азотна струя. След това хладникът се измива с приблизително 20 ml вода и съдържанието на колбата се охлажда до стайна температура. 5.3. Извличане Осапуняващият разтвор се прехвърля количествено чрез декантиране с измиване с общ обем от 250 ml вода в 1000 ml разделяща фуния (4.2.3) или в екстракционния апарат (4.8). Осапунисващата колба се измива последователно с 25 ml етанол (3.1) и 100 ml петролен етер (3.2) и отмитото се прехвърля в разделящата фуния или в екстракционния апарат. Пропорцията на водата и етанола в комбинираните разтвори трябва да бъде около 2:1. Разтръсква се енергично 2 min се оставя да се утаи 2 min. 5.3.1. Екстракция с използване на разделителна фуния (4.2.3) Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3) слоят на петролевият етер се прехвърля в друга разделителна фуния (4.2.3). Тази екстракция се повтаря 2 пъти със 100 ml петролев етер (3.2) и два пъти с 50 ml петролев етер (3.2). Комбинираните екстракти в разделящите фунии се измиват два пъти чрез внимателно завихряне (за да се избегне образуването на емулсии) със 100 ml вода и след това чрез повторно разтръскване с нови 100 ml вода, докато водата остане безцветна при добавяне на разтвор на фенолфталеин (3.7) (измиването четири пъти обикновено е достатъчно). Измитият екстракт се филтрира през сух нагънат филтър за фазово разделяне (4.4), за да се отстрани суспендирана вода, в мерителна колба от 500 ml (4.2.2). Разделителната фуния и филтърът се измиват с 50 ml петролев етер (3.2), долива се до отметката с петролев етер (3.2) и се смесва добре. 5.3.2. Екстракция с използване на екстракционен апарат (4.8) Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), запушалката на стъкления цилиндър се заменя (4.8.1) със загладена стъклена вложка (4.8.2) и долният край с U-форма на регулируемата тръба се разполага така, че тя да е точно над нивото на интерфейса. Чрез прилагане на налягане от азотна линия на страничното рамо горният слой петролев етер се прехвърля в разделителна фуния от 1000 ml (4.2.3). Добавят се 100 ml петролев етер (3.2) в стъкления цилиндър, запушва се и се разтръсква добре. Слоевете се оставят да се разделят и горният слой се прехвърля в разделителната фуния както преди. Екстракционната процедура се повтаря с допълнителни 100 ml петролев етер (3.2), след това два пъти с 50 ml части петролев етер (3.2) и слоевете петролев етер се добавят в разделителната фуния. Комбинираните екстракти на петролев етер се измиват, както е описано в 5.3.1, и се продължава, както е описано там. 5.4. Приготвяне на разтвор на образеца за HPLC Отпипетирва се аликвотна част на разтвора на петролевия етер (от 5.3.1 или 5.3.2) в крушовидна колба от 250 ml (4.2.4). Разтворителят се изпарява почти до сухо на ротационния изпарител (4.1) с намалено налягане при температура на ваната непревишаваща 40 °C. Атмосферното налягане се възстановява чрез допускане на азот (3.10) и колбата се маха от ротационния изпарител. Останалият разтворител се отстранява с поток на азот (3.10) и остатъкът незабавно се разтваря в известен обем (10-100 ml) метанол (3.3) (концентрацията на витамин A трябва да бъде в обхвата от 5 до 30 IU/ml). 5.5 Определяне с HPLC Витамин A се отделя в C18 колона обърната фаза (4.5.1) и концентрацията се измерва посредством УВ детектор (325 nm) или флуоресцентен детектор (възбуждане: 325 nm, емисия 475 nm) (4.5.2). Аликвотна част 20 μl метанолов разтвор, получен в 5.4, се инжектира и се разрежда с мобилната фаза (3.9). Изчисляват се средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на същата проба и средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на калиброващи разтвори (5.6.2). HPLC условия Следните условия се предлагат като насока. Могат да се използват други условия при условие, че дават еквивалентни резултати. Течна хроматографска колона (4.5.1) – 250 mm x 4 mm, C18,5 или 10 пълнеж μm или еквивалентен Подвижна фаза – смес от метанол (3.3) и вода, e.g. 980+20 (v+v) скорост на изтичане – 1-2 ml/min детектор (4.5.2.) – УВ детектор (325 nm) или флуоресцентен, с регулиране дължината на вълната 325 nm, 475 nm. 5.6. Калибриране 5.6.1. Приготвяне на работни еталонни разтвори Отпипетирват се 20 ml изходен разтвор на ацетат на витамин A (3.11.1) или 20 ml изходен разтвор на палмитат на витамин A (3.12.1) в плоскодънна и ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1) и се хидролизират, както е описано в 5.2, но без добавяне на BHT. След това се извлича с петролев етер (3.2) съгласно 5.3 и се долива до 500 ml петролев етер (3.2). 100 ml от този екстракт се изпаряват на ротационен изпарител (вж. 5.4) почти до сухо, останалият разтворител се отстранява с азотна струя (3.10) и остатъкът се разтваря отново в 10 ml метанол (3.3). Номиналната концентрация на този разтвор е 560 IU витамин A на ml. Точното съдържание се определя съгласно 5.6.3.3. Работният еталонен разтвор се приготвя непосредствено преди използване. Отпипетирват се 2 ml от този работен еталонен разтвор в мерителна колба 20 ml, долива се метанол (3.3) до отметката и се смесва. Номиналната концентрация на този разреден работен еталонен разтвор е 56 IU витамин A на ml. 5.6.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика 1, 2, 5 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби от 20 ml, долива се метанол (3.3) до отметката и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,8; 5,6; 14 и 28 IU витамин A на ml. 20 μl от всеки калибриращ разтвор се инжектират няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика и като се вземат предвид резултатите от УВ контрола, се начертава калибриращата графика. 5.6.3. УВ стандартизация на еталонни разтвори 5.6.3.1. Изходен разтвор на ацетат на витамин A Отпипетирват се 2 ml изходен разтвор на ацетат на витамин A (3.11.1) в мерителна колба от 50 ml (4.2.2) и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 56 IU витамин A на ml. Отпипетирват се 3,0 ml от този разреден разтвор на ацетат на витамин A в мерителна колба от 25 ml и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин A на ml. Измерва се УВ спектърът на разтвора спрямо 2-пропанол (3.8) в спектрофотометъра (4.6) в обхвата между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкцията трябва да бъде между 325 nm и 327 nm. Изчисление на съдържанието на витамин A: IU витамин A на ml = E_{126} \times 19.0 E_{1\text{cm}}^{1\%} от витамин A палмитат = 957 и 326 nm в 2-пропанол. 5.6.3.2. Работен еталонен разтвор на витамин A Отпипетирват се 3 ml неразреден работен еталонен разтвор на витамин A, приготвен съгласно 5.6.1, в мерителна колба от 50 ml (4.2.2) и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Отпипетирват се 5 ml от този разтвор в мерителна колба от 25 ml и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин A на 1 ml. УВ спектърът на разтвора се измерва спрямо 2-пропанол (3.8) в спектрофотометъра (4.6) в обхвата между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкцията трябва да бъде между 325 nm и 327 nm. Изчисление на съдържанието на витамин A: IU витамин A на ml = E_{325} \times 18,3 E_{1\text{cm}}^{1\%} от витамин A алкохол = 1821 и 325 nm в 2-пропанол 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин A на разтвора на пробата с помощта на калибриращата графика (5.6.2) се определя концентрацията на разтвора на пробата в IU/ml. Съдържанието на витамин A w в IU/kg на пробата се дава със следната формула: 500.\beta.V_2.1000 w = \frac{V_1 \text{ m}}{V_1 \text{ m}}, където: \beta е концентрацията на разтвора на пробата (5.4) в IU/ml; V_1 – обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml; V_2 – обемът на аликвота, взет в (5.4) в ml; m – масата на тествана част в g. 7. Забележки 7.1. За проби с ниска концентрация на витамин A може да е полезно да се комбинират екстрактите на петролевия етер на две осапуняващи зареждания (измерено количество: 25 g) в един разтвор на проба за HPLC определяне. 7.2. Теглото на пробата, взета за анализ, не трябва да съдържа повече от 2 g мазнина. 7.3. Ако не стане разделяне на фазите, се добавят приблизително 10 ml етанол (3.1), за да се разбие емулсията. 7.4. При масло от дроб на треска и други чисти мазнини времето на осапуняването се удължава на 45 – 60 min. 7.5. Вместо ВНТ може да се използва хидрохинон. 7.6. Възможно е използването на колона нормална фаза за разделяне на изомерите на ретинола. 7.7. Вместо разтвор на натриев аскорбат могат да се използват приблизително 150 mg аскорбинова киселина. 7.8. Вместо разтвор на натриев сулфид могат да се използват приблизително 50 mg EDTA. 8. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да превишават 15% спрямо най-високия резултат. 9. Резултати от съвместно междулабораторно изследване Премикс Премикс фураж Минерален концентрат Протеин фураж Piglet L 13 12 13 12 13 n 48 45 47 46 49 Mean [IU/kg] 17.02x106 1.21 x106 537 100 151 800 18 070 Sn[IU/kg] 0.51 x106 0.039 x106 22 080 12 280 682 r[IU/kg] 1.43 x106 0.109 x106 61 824 34 384 1910 CVr[%] 3.0 3.5 4.1 8.1 3.8 SR 1.36 x106 0.069 x106 46 300 23 060 3614 R 3.81 x106 0.193 x106 129 640 64 568 10 119 CVR[%] 8.0 6.2 8.6 15 20 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; S_f – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_f – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVII. Определяне на витамин E 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на витамин E в животински храни и предварително приготвени смеси. Съдържанието на витамин E се изразява като mg DL-\alpha-токоферол ацетат на kg. Един милиграм DL-\alpha-токоферол ацетат отговаря на 0,91 mg DL-\alpha-токоферол (витамин E). Границата на определяне е 2 mg витамин E/kg. 2. Принцип Пробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин E се извлича в петролев етер. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин E се определя чрез висококачествена течна хроматография обратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор. 3. Реагенти 3.1. етанол, \sigma = 96\%; 3.2. лек петролев етер, обхват на кипене 40 ° до 60 °C; 3.3. метанол; 3.4. разтвор на калиев хидроксид, \beta = 50\text{g/}100\text{ ml}; 3.5. разтвор на натриев аскорбат, \beta = 50\text{g/}100\text{ ml} (вж. 7.7 забележки); 3.6. натриев сулфид, \text{Na}_2\text{S}\cdot \text{xH}_2\text{O} (x = 7 - 9); 3.6.1. разтвор на натриев сулфид, c = 0,5\text{ mol/l} в глицерол, \beta = 120\text{g/l} (за x = 9) (вж. 7.8 забележки); 3.7. фенолфталеинов разтвор, \beta = 2\text{ g/}100\text{ ml} в етанол (3.1); 3.8. мобилна фаза за HPLC: смес на метанол (3.3) и вода, напр. 980 + 20 (V + V). Точното съотношение се определя от характеристиките на използваната колона; 3.9. азот, без съдържание на кислород; 3.10. DL-\alpha-токоферол ацетат, свръхчист, със сертифицирана активност; 3.10.1. изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол ацетат – с точност до 0,1 mg се претеглят 100 mg DL-\alpha-токоферол ацетат (3.10) в мерителна колба от 100 ml. Разтварят се в етанол (3.1) и със същия разтворител се долива до отметката. 1 ml от този разтвор съдържа 1 mg DL-\alpha-токоферол ацетат (УВ контрол, вж. 5.6.1.3; стабилизиране, вж. 7.4 забележки); 3.11. DL-\alpha-токоферол, свръхчист, със сертифицирана активност; 3.11.1. с точност до 0,1 mg се претеглят 100 mg DL-\alpha-токоферол (3.10) в мерителна колба от 100 ml. Разтварят се в етанол (3.1) и същия разтворител се долива до отметката. 1 ml от този разтвор съдържа 1 ml DL-\alpha-токоферол (УВ контрол, вж. 5.6.1.3; стабилизиране, вж. 7.4 забележки); 3.12. 2,6-DI-tert-butil-4-метилфенол (ВНТ) (виж 7.5 ); 4. Апаратура 4.1. вакуумен ротационен изпарител; 4.2. стъклария от тъмно стъкло; 4.2.1. плоскодънни или ерленмайерови колби, 500 ml, със загладен разширен край; 4.2.2. мерителни колби с плоски запушалки, тясно гърло, 10, 25, 100 и 500 ml; 4.2.3. разделящи фунии, конични, 1000 ml, със загладени стъклени запушалки; 4.2.4. крушовидни колби, 250 ml, със загладени стъклени запушалки; 4.3. хладник на Allihn, дължина на ризата 300 mm, със загладен свързващ елемент, с адаптер за подаващата газ тръба; 4.4. нагъната филтърна хартия за разделяне на фазите, диаметър 185 mm (напр. Schleicher & Schuell 597 HY ½); 4.5. HPLC оборудване с инжекционна система; 4.5.1. течна хроматографска колона, 250 mm x 4 mm, C_{18}, 5 или 10 \mu\text{m} пълнеж или еквивалентна (изискване към качеството на работа: само единичен пик за всички изомери на ретинола при условията на HPLC); 4.5.2. УВ или флуоресцентен детектор с регулиране дължината на вълната; 4.6. спектрофотометър с кварцови клетки 10 mm; 4.7. водна вана с магнитна бъркалка; 4.8. екстракционен апарат (вж. фигурата), състоящ се от: 4.8.1. стъклен цилиндър с обем 1 l, снабден със загладено стъклено гърло и запушалка; 4.8.2. загладена стъклена вложка със странично рамо и регулируема тръба, минаваща през центъра; регулируемата тръба има долен край с U-форма и дюза на противоположния край, така че горният течен слой в цилиндъра да може да се прехвърля в разделяща фуния. 5. Процедура Забележка. Витамин E е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиево фолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва се излишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време). 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се смила така, че да минава през мрежесто сито с отвори 1 mm, като се внимава да се избягва генериране на топлина. Смилането се извършва непосредствено преди претеглянето и осапуняването. В противен случай може да има загуби на витамин E. 5.2. Осапуняване В зависимост от съдържанието на витамин E с точност до 0,01 g се претеглят от 2 до 25 g от пробата в плоскодънна или ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1). Добавят се последователно със завихряне 130 ml етанол (3.1), приблизително 100 mg BHT (3.13), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид (3.6). Хладникът се свързва (4.3) към колбата и тя се потапя във водна вана с магнитна бъркалка (4.7). Загрява се до кипене и се оставя да се нагрее с обратен хладник за 5 min. След това се добавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид (3.4) през хладника (4.3) и се оставя да се нагрее с обратен хладник за още 25 min, като се разбърква под азотна струя. След това хладникът се измива с приблизително 20 ml вода и съдържанието на колбата се охлажда до стайна температура. 5.3. Извличане Чрез декантиране осапуняващият разтвор се прехвърля количествено чрез измиване с общ обем от 250 ml вода в 1000 ml разделяща фуния (4.2.3) или в екстракционния апарат (4.8). Осапунисващата колба се измива последователно с 25 ml етанол (3.1) и 100 ml петролев етер (3.2) и отмитото се прехвърля в разделящата фуния или в екстракционния апарат. Пропорцията на водата и етанола в комбинираните разтвори трябва да бъде около 2:1. Разтръсква се енергично две минути и се оставя да се утаи 2 min. 5.3.1. Екстракция с използване на разделителна фуния (4.2.3) Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), слоят на петролевия етер се прехвърля в друга разделителна фуния (4.2.3). Тази екстракция се повтаря два пъти със 100 ml петролев етер (3.2) и два пъти с 50 ml петролев етер (3.2). Комбинираните екстракти в разделящите фунии се измиват два пъти чрез внимателно завихряне (за да се избегне образуването на емулсии) със 100 ml вода и след това чрез повторно разтръскване с нови 100 ml вода, докато водата остане безцветна при добавяне на разтвор на фенолфталеин (3.7) (обикновено измиването четири пъти е достатъчно). Измитият екстракт се филтрира през сух нагънат филтър за фазово разделяне (4.4), за да се отстрани суспендирана вода, в мерителна колба от 500 ml (4.2.2). Разделителната фуния и филтърът се измиват с 50 ml петролев етер (3.2), долива се с петролев етер (3.2) до отметката и се смесва добре. 5.3.2. Екстракция с използване на екстракционен апарат (4.8) Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), запушалката на стъкления цилиндър се заменя (4.8.1) със загладена стъклена вложка (4.8.2) и долният край с U-форма на регулируемата тръба се разполага така, че тя да е точно над нивото на интерфейса. Чрез прилагане на налягане от азотна линия на страничното рамо горният слой петролев етер се прехвърля в разделителна фуния от 1000 ml (4.2.3). Добавят се 100 ml петролев етер (3.2) в стъкления цилиндър, запушва се и се разтръсква добре. Оставя се слоевете да се разделят и горният слой се прехвърля в разделителната фуния както преди. Екстракционната процедура се повтаря с допълнителни 100 ml петролев етер (3.2), след това два пъти с 50 ml части петролев етер (3.2) и се добавят слоевете петролен етер в разделителната фуния. Комбинираните екстракти на петролен етер се измиват, както е описано в 5.3.1, и се продължава, както е описано там. 5.4. Приготвяне на разтвор на пробата за HPLC Отпипетирва се аликвотна част на разтвора на петролния етер (от 5.3.1 или 5.3.2) в крушовидна колба 250 ml (4.2.4). Разтворителят се изпарява почти до сухо на ротационния изпарител (4.1) с намалено налягане при температура на ваната непревишаваща 40 °C. Атмосферното налягане се възстановява чрез допускане на азот (3.9) и колбата се отстранява от ротационния изпарител. Останалият разтворител се отстранява с поток на азот (3.9) и остатъкът незабавно се разтваря в известен обем (10 – 100 ml) метанол (3.3) (концентрацията на DL-\alpha-токоферол трябва да бъде в обхвата от 5 µg/ml до 30 µg/ml). 5.5. Определяне с HPLC Витамин E се отделя в C18 колона обърната фаза (4.5.1) и концентрацията се измерва посредством флуоресцентен детектор (възбуждане: 295 nm, емисия 330 nm) или УВ детектор (292 nm) (4.5.2). Аликвотна част 20 µl метанолов разтвор, получен в 5.4, се инжектира и се разрежда с мобилната фаза (3.8). Изчислява се средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на същата проба и средноаритметичните височини (площи) на пика на няколко инжектирания на разтвор на калиброващи разтвори (5.6.2). HPLC условия Условия се предлагат като насока. Могат да се използват други условия при условие, че дават еквивалентни резултати. Течна хроматографска колона (4.5.1) – 250 mm × 4 mm, C18,5 или 10 µm пълнеж или еквивалентен Подвижна фаза – смес от метанол (3.3), и вода, e.g. 980+20 (v+v) скорост на изтичане – 1 – 2 ml/min дедектор(4.5.2) – флуоресцентен дедектор, с регулиране дължината на вълната емисия 295 nm, 330 nm или UV дедектор (292 nm) 5.6. Калибриране (DL-\alpha-токоферол ацетат или DL-\alpha-токоферол. 5.6.1. Еталон на DL-\alpha-токоферол ацетат 5.6.1.1. Приготвяне на работен еталонен разтвор Посредством пипета се прехвърлят 25 ml изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол ацетат (3.10.1) в плоскодънна или ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1) и се хидролизира, както е описано в 5.2. След това се извлича с петролев етер (3.2) съгласно 5.3 и се долива до 500 ml петролев етер (3.2). 25 ml от този екстракт се изпаряват на ротационен изпарител (вж. 5.4) почти до сухо, останалият разтворител се отстранява с азотна струя (3.9) и остатъкът се разтваря отново в 25,0 ml метанол (3.3). Номиналната концентрация на този разтвор е 45,5 µg DL-\alpha-токоферол на 1 ml, което е еквивалентно на 50µg DL-\alpha-токоферол ацетат на 1 ml. Работният еталонен разтвор се приготвя непосредствено преди употреба. 5.6.1.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика 1, 2, 4 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби по 20 ml, долива се с метанол (3.3) до отметката и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,5; 5, 10 и 25 µg/ml DL-\alpha-токоферол ацетат, т.е. 2,28; 4,55; 9,10µg/ml и 22,8 µg/ml DL-\alpha-токоферол. 20µl от всеки калибриращ разтвор се инжектират няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика, се начертава калибриращият граф. 5.6.1.3. УВ стандартизация на изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол ацетат (3.10.1) 5 ml изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол ацетат (3.10.1) се разтварят до 25,0 ml с етанол и се измерва УВ спектърът на този разтвор спрямо етанол (3.1) в спектрофотометър (4.6) между 250 nm и 320 nm. Максимумът на поглъщане трябва да бъде при 284 nm: E \frac{1\%}{1\text{cm}} = 43,6 \text{ в 284 nm в етанол} При това разреждане трябва да се получи екстинкционна стойност между 0,84 и 0,88. 5.6.2. Еталон на DL-\alpha-токоферол – стандартен 5.6.2.1. Приготвяне на работен еталонен разтвор Посредством пипета се прехвърлят 2 ml изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол (3.11.1) в мерителна колба от 50 ml, разтварят се в метанол (3.3) и с метанол се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 40 µg DL-\alpha-токоферол на 1 ml, което е еквивалентно на 44µg DL-\alpha-токоферол ацетат на 1 ml. Работният еталонен разтвор се приготвя непосредствено преди употреба. 5.6.2.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика 1, 2, 4 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби от по 20 ml, долива се до отметката с метанол (3.3) и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2, 4, 8 и 20 µg/ml DL-\alpha-токоферол, т.е. 2,20; 4,40; 8,79 и 22 µg/ml DL-\alpha-токоферол ацетат. 20µl от всеки калибриращ разтвор се инжектират няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика, се начертава калибриращият граф. 5.6.2.3. УВ стандартизация на изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол (3.11.1) 2 ml изходен разтвор на DL-\alpha-токоферол (3.11.1) се разтварят до 25 ml с етанол и се измерва УВ спектърът на този разтвор спрямо етанол (3.1) в спектрофотометър (4.6) между 250 nm и 320 nm. Максимумът на поглъщане трябва да бъде при 292 nm: E \frac{1\%}{1\text{cm}} = 75,8 \text{ в 292 nm в етанол} При това разреждане трябва да се получи екстинкционна стойност 0,6. От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин A на разтвора на пробата се определя концентрацията на разтвора на пробата в IU/ml с помощта на калибриращата графика (5.6.2). 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин E на разтвора на пробата се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml (изчислена като \alpha-токоферол ацетат) с помощта на калибриращата графика (5.6.1.2 или 5.6.2.2). Съдържанието на витамин E w в mg/kg на пробата се определя със следната формула: W = \frac{500.\beta \cdot V_2}{V_1 \cdot m} [\text{mg/kg}] където: \beta е концентрацията на витамин E в разтвора на пробата (5.4) в IU /ml; V_1 – обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml; V_2 – обемът на аликвота, взет в 5.4 в ml; m – масата на тествана част в g. 7. Забележки 7.1. За проби с ниска концентрация на витамин E може да е полезно да се комбинират екстрактите на петролевия етер на две осапуняващи зареждания (измерено количество: 25 g) в един разтвор на проба за HPLC определяне. 7.2. Теглото на пробата, взета за анализ, не трябва да съдържа повече от 2 g мазнина. 7.3. Ако не стане разделяне на фазите, за да се разбие емулсията, се добавят приблизително 10 ml етанол (3.1). 7.4. След спектрофотометричното измерване на разтвора на DL \alpha-токоферол ацетат съгласно 5.6.1.3 или 5.1.6.2.3 съответно се прибавят приблизително 10 mg BMT (3.12) към разтвора (3.10.1 или 3.10.2) и разтворът се съхранява в хладилник (срок на годност максимум 4 седмици). 7.5. Вместо BHT може да се използва хидрохинон. 7.6. Възможно е използването на колона нормална фаза за разделяне на изомерите на ретинола. 7.7. Вместо разтвор на натриев аскорбат могат да се използват приблизително 150 mg аскорбинова киселина. 7.8. Вместо разтвор на натриев сулфид могат да се използват приблизително 50 mg EDTA. 8. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща проба, не трябва да превишават 15 % спрямо най-високия резултат. 9. Резултати от съвместно междулабораторно изследване: Премикс Премикс фураж Минерален концентрат Протеин фураж Piglet L 12 12 13 12 13 n 48 48 48 48 48 Mean [mg/kg] 17380 1187 926 315 61,3 S_{\text{[mg/kg]}} 384 45,3 25,2 13,0 2,3 r[\text{mg/kg}] 1075 126,8 70,6 36,4 6,4 CV_{\text{[%]}}: 2,2 3,8 2,7 4,1 3,8 S_{\text{[mg/kg]}} 830 65,0 55,5 18,9 7,8 R[\text{mg/kg}] 2324 182,0 155,4 52,9 21,8 CV_{\text{[%]}}: 4=8 5,5 6,0 6,0 6,0 12,7 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_{\text{R}} – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_{\text{R}} – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_{\text{r}} – коефициент на вариации на възпроизводимост. XLVIII. Определяне на триптофан 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на общото съдържание и свободния триптофан в животински храни. Той не различава D и L формите. 2. Принцип За да се определи общото съдържание на триптофан, пробата се хидролизира в алкална среда с наситен разтвор на бариев хидроксид и се нагрява до 110 °C в продължение на 20 h. След хидролизата се добавя вътрешен еталон. За да се определи свободният триптофан, пробата се извлича в слабо кисела среда в присъствието на вътрешен еталон. Триптофанът и вътрешният еталон в хидролизата или екстракта се определят с помощта на HPLC с флуоресцентна детекция. 3. Реагенти: 3.1. използва се двойно дестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < \mu\text{S/cm}); 3.2. еталонна субстанция: триптофан (чистота/съдържание \geq 99 \%), изсушена под вакуум над фосфорен пентоксид; 3.3. вътрешна еталонна субстанция: -\alpha-метил-триптофан (чистота/съдържание \geq 99 \%), изсушена под вакуум над фосфорен пентоксид; 3.4. бариев хидроксид октахидрат (внимава се да не се излага \text{Ba}(\text{OH})_2 \cdot 8\text{H}_2\text{O} черезмерно на въздух, за да се избегне формирането на \text{BaCO}_3, което може да обърка определянето); (вж. забележка 9.3); 3.5. натриев хидроксид; 3.6. орто-фосфорна киселина, w = 85 \%; 3.7. солна киселина, \rho_{20} = \text{g/ml}; 3.8. метанол, HPLC клас; 3.9. петролев етер, обхват на кипене 40 – 60 °C; 3.10. разтвор на натриев хидроксид, c = 1 \text{ mol/l} - 40,0 \text{ g NaOH} се разтварят (3.5) във вода и се долива до 1 l с вода (3.1); 3.11. солна киселина, c = 6 \text{ mol/l} - \text{взимат се } 492 \text{ ml HCl (3.7)} и се долива до 1 l с вода; 3.12. солна киселина, c = 1 \text{ mol/l} - \text{взимат се } 82 \text{ ml HCl (3.7)} и се долива с вода до 1 l; 3.13. солна киселина, c = 0,1 \text{ mol/l} - \text{взимат се } 8,2 \text{ ml HCl (3.7)} и се долива с вода до 1 l; 3.14. орто-фосфорна киселина, c = 0,5 \text{ mol/l} - \text{взимат се } 34 \text{ ml орто-фосфорна киселина (3.6)} и се долива вода (3.1) до 1 l; 3.15. концентриран разтвор на триптофан (3.2), c = 2,50 \text{ } \mu\text{mol/ml} - \text{в мерителна обемна колба се разтварят } 0,2553 \text{ g триптофан (3.2)} в солна киселина (3.13) и до отметката се долива със солна киселина (3.13). Съхранява се при – 18 °C максимум четири седмици; 3.16. концентриран вътрешен еталонен разтвор, c = 2,50 \text{ } \mu\text{mol/ml} - \text{в мерителна обемна колба се разтварят } 0,2728 \text{ g } -\alpha\text{-метил-триптофан (3.3)} в солна киселина (3.13) и до отметката се долива със солна киселина (3.13). Съхранява се при – 18 °C максимум четири седмици; 3.17. калибриращ еталонен разтвор на триптофан и на вътрешен еталон – взимат се 2 ml концентриран разтвор на триптофан (3.15) и 2 ml концентриран разтвор на вътрешен еталон (-\alpha-метил – триптофан) (3.16). Разрежда се с вода (3.1) и метанол (3.8) до приблизително същия обем и до приблизително същата концентрация на метанол (10 – 30 %) като при получения хидролизат. Този разтвор се приготвя непосредствено преди използване. При приготвянето се защитава от пряка слънчева светлина; 3.18. оцетна киселина; 3.19. 1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол; 3.20. етаноламин > 98 %; 3.21. разтвор на 1 g 1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол (3.19) в 100 ml метанол (3.8); 3.22. мобилна фаза за HPLC – 3,00 g оцетна киселина (3.18) + 900 ml вода (3.1) + 50,0 ml разтвор (3.21) на 1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол (3.19) в метанол (3.8) (1 g/100 ml). Стойността на pH се коригира до 5, като използвате етаноламин (3.20). Долива се до 1000 ml с вода (3.1). 4. Апарати: 4.1. HPLC оборудване със спектрофлуориметричен детектор; 4.2. течна хроматографска колона, 125 mm \times 4 mm, C18, пълнеж 3 \mum или еквивалентна; 4.3. pH метър; 4.4. полипропиленова колба, обем 125 ml, с широко гърло и винтова запушалка; 4.5. мембранен филтър, 0,45 \mum; 4.6. автоклав, 110 (\pm2) °C, 1,4 (\pm0,1) bar; 4.7. механичен вибратор или магнитна бъркалка; 4.8. вихров смесител. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробите Пробата се смила, за да минава през сито с квадратни отвори по 0,5 mm. Пробите с високо съдържание на влага се изсушават на въздух при температура, непревишаваща 50 °C, или лиофизирани преди смилане. Проби с високо съдържание на мазнини се извличат с петролев етер (3.9) преди смилане. 5.2. Определяне на свободен триптофан (екстракт) С точност до 1 mg се претегля подходящо количество (1 – 5 g) от приготвената проба (5.1) в ерленмайерова колба. Добавят се 100 ml солна киселина с = 0,1 mol/l (3.13) и 5 ml концентриран вътрешен еталонен разтвор (3.16). Разтъсква се или се смесва за 60 min, като се използва механичен вибратор или магнитна бъркалка (4.7). Седиментът се оставя да се утаи и се отпипетирват 10 ml разтвор от плаващия отгоре слой в бехерова чаша. Добавят се 5 ml ортофосфорна киселина, с = 0,6 mol/l (3.14). Стойността на pH се коригира до 3, като се използва натриев хидроксид, с = 1 mol/l (3.10). Добавя се достатъчно метанол (3.8), за да се постигне концентрация на метанола в крайния обем между 10 и 30 %. Прехвърля се в обемна мерителна колба с подходящ обем и се разтворя с вода до обема, необходим за хроматографията (приблизително същия обем като на калибриращия еталонен разтвор (3.17)). Няколко ml от разтвора се филтруват през мембранен филтър 0,45 \mum (4.5) преди инжектиране в HPLC колоната. Преминава се към хроматографията съгласно 5.4. Необходимо е еталонният разтвор и екстрактите да се защитят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират екстрактите същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при 5 °C максимум 3 дни. 5.3. Определяне на общото съдържание на триптофан (хидролизат). С точност 0,2 mg се претеглят от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1) в полипропиленовата колба (4.4). Претеглената част от пробата трябва да има съдържание на азот около 10 mg. Добавят се 8,4 g бариев хидроксид окта-хидрат (3.4) и 10 ml вода. Смесва се на вихров смесител (4.8) или магнитна бъркалка (4.7). Покритият с тефлон магнит се оставя в сместа. Стените на съда се измиват с 4 ml вода. Поставя се винтовата запушалка и колбата се затваря хлабаво. Прехвърля се в автоклав при температура 110 (\pm2) °C за 20 h. Преди да се отвори автоклавът, температурата се намалява до точно под 100 °C. За да се избегне кристализацията на Ba(OH)2.8H2O, към топлата смес се добавят 30 ml вода, която е със стайна температура. Разтъсква се или се разбърква нежно. Добавят се 2 ml концентриран вътрешен еталон (-\alpha-метил – триптофан) разтвор (3.16). Съдовете се охлаждат във водна/ледена вана в продължение на 15 min. След това се добавят 5 ml ортофосфорна киселина, с = 0,5 mol/l (3.14). Съдът се държи в охлаждащата вана и се неутрализира с HCl, с = 6 mol/l (3.11). Добавя се достатъчно метанол, за да се постигне концентрация на метанола в крайния обем между 10 и 30 %. Прехвърля се в мерителна обемна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до определения обем, необходим за хроматографията (например 100 ml). Добавянето на метанол не трябва да причинява утаяване. Няколко ml от разтвора се филтрират през мембранен филтър 0,45 \mum (4.5) преди инжектиране в HPLC колоната. Преминава се към хроматографията съгласно 5.4. Необходимо е еталонният разтвор и екстрактите да се защитят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират екстрактите същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при 5 °C максимум 3 дни. 5.4. Определяне с помощта на HPLC Предлагат се следните условия като насоки за изократично елуиране. Могат да се използват други условия, при условие че дават еквивалентни резултати (вж. също забележки 9.1 и 9.2): Течно-хроматографска колона (4.2) – 125 mm \times 4 mm, C_{18,3} \mu\text{m} пълнеж или еквивалентен Температура на колоната – стайна температура Подвижна фаза (3.22) – 3 g оцетна киселина (3.18) + 900 ml вода (3.1) + 50,0 ml разтвор (3.21) от смес от 1,1,1-трихлоро-2-метил-2-пропанол (3.19) в 100 ml метанол (3.8) при pH 5,0 на етаноламид (3.20) Скорост на изтичане – 1000 ml с вода (3.1) Общо време – приблизително 34 min Дължина на вълната – excitation & 280 nm, emission 356 nm Допълващ разтвор – 20 ml 6. Изчисляване на резултати A.B.C.D.E.MW —= g триптофан pd 100 g проба, F.G.H.10 000.W където: A е площта на пика на вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор (3.17); B – площта на пика на триптофан, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3); C – обемът в ml (2 ml) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до калибриращия разтвор (3.17); D – концентрация в \mu\text{mol/ml} (=2,50) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до калибриращия разтвор (3.17); E – обем в ml на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен при екстракцията (5.2) (= 5,00 ml) или към хидролизата (5.3) (=2); F – площта на пика на вътрешния еталон, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3); G – площта на пика на триптофан, калибриращ стандартен разтвор (3.17); H – обемът в ml (=2 ml) на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен към калибриращия еталонен разтвор (3.17); W – теглото на пробата в g (коригирано или оригинално тегло, ако е изсушавана или са отнемани мазнини); MW – молекулното тегло на триптофан (=204,23). 7. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да превишават 10 % спрямо най-високия резултат. 8. Резултати от съвместното изследване При организиране на съвместно изследване, в което три проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа) се анализират в 12 лаборатории, за да се сертифицира методът за хидролиза, се получават следните резултати, дадени в таблицата: Проба 1 Фураж за свине Проба 2 Фураж за свине с L-триптофан Проба 3 L 12 12 12 n 50 55 50 Mean [g/kg] 2,42 3,40 4,22 S_r[\text{g/kg}] 0,05 0,05 0,08 r[\text{g/kg}] 0,14 0,14 0,22 CV_r[\%]: 1,9 1,6 1,9 S_R[\text{g/kg}] 0,15 0,20 0,09 R[\text{g/kg}] 0,42 0,56 0,25 CV_R[\%]: 6,3 6,0 2,2 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост. При друго съвместно изследване, в което две проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа) се анализират в 13 лаборатории, за да се сертифицира методът за извличане на свободния триптофан, се получават резултатите, дадени в таблицата: Проба 4 Смес от пшеница и соя Проба 5 Смес от пшеница и соя = проба 4 с триптофан (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Mean [g/kg] 0,391 0,931 S_r[\text{g/kg}] 0,005 0,012 r[\text{g/kg}] 0,014 0,034 CV_r[\%]: 1,34 1,34 S_R[\text{g/kg}] 0,018 0,048 R[\text{g/kg}] 0,050 0,134 CV_R[\%]: 4,71 5,11 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; S_R – стандартно отклонение на повторяемостта; CV_R – коефициент на вариации на повторяемост; s_r – стандартно отклонение на възпроизводимост; CV_r – коефициент на вариации на възпроизводимост. При изследване, в което четири проби (на всяка проба бяха извършени по 5 анализа) бяха анализирани в 7 лаборатории, с цел да се сертифицира триптофан за хидролиза се получават резултатите, дадени в таблицата: Проба 1 Фураж за свине (CRM 117) Проба 2 Рибно брашно с ниско съдържание на мазнини (CRM 118) Проба 3 Соево брашно (CRM 119) Проба 4 Обезмаслено мляко на прах (CRM 120) L 7 7 7 7 N 25 25 25 25 Mean [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr[g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r[g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr[%]: 1,04 1,15 1,30 0,76 SR[g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R[g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR[%]: 1,48 4,69 4,11 4,22 L – брой на лабораториите; n – брой на индивидуалните стойности; SR – стандартно отклонение на повторяемостта; CVR – коефициент на вариации на повторяемост; sr – стандартно отклонение на възпроизводимост; CVr – коефициент на вариации на възпроизводимост. 9. Наблюдения 9.1. Следните специални хроматографски условия могат да дадат по-добро разделяне между триптофан и \alpha-метил-триптофан Изократна елюция, последвана от градиент на чистотата на колоната: Течно-хроматографска колона – 125 mm × 4 mm, C18, 5 \mum пълнеж или еквивалентен Температура на колоната – 32 ° Подвижна фаза – A – 0,01 mol/l KH2PO4/ метанол, 95+5 ( V + V) В - метанол Степенна програма 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Скорост на изтичане – 1,2 ml/ min Общо време – приблизително 33 min 9.2. Хроматографията ще варира в зависимост от типа на HPLC и използвания материал за пълнеж на кулата. Избраната система трябва да бъде в състояние да даде основната сепарация между триптофан и вътрешния еталон. Нещо повече, важно е продуктите на разлагане да са добре разделени от триптофан и вътрешния еталон. Трябва да се подложат на изпитване хидролизати без вътрешен еталон, за да се провери базовата линия под вътрешния еталон за примеси. Важно е времето за провеждане на изпитанието да бъде достатъчно дълго за елуиране на всички продукти на разлагането. В противен случай късни елуитни пикове могат да окажат въздействие върху последващите хроматографски изпитания. В обхвата на работа хроматографската система трябва да дава линейна реакция. Линейната реакция трябва да се измерва с постоянна (нормалната) концентрация на вътрешния еталон и вариращите концентрации на триптофан. Важно е размерът на пиковете на триптофана и вътрешният еталон да са в рамките на линейния обхват на HPLC/ флуоресцентната система. Ако пика(овете) на триптофан и/или вътрешния еталон е (са) твърде малки или твърде високи, анализът трябва да се повтори с друг размер проба и/или да се промени крайният обем. 9.3. Бариев хидроксид С времето става все по-трудно разтварянето на бариевия хидроксид. Това води до не бистър разтвор за определяне с помощта на HPLC, което може да доведе до ниски резултати за триптофан.